重組野蠶絲素含RGD肽段的制備與表征.pdf

1、絲素是由蠶合成與分泌的天然蛋白質(zhì)，包括家蠶絲素和野蠶（柞蠶、天蠶、蓖麻蠶、栗蠶、樟蠶和大山蠶等）絲素。目前對絲素蛋白的研究主要集中在家蠶絲素蛋白方面，大量的研究表明家蠶絲素蛋白材料能支持多種細胞的粘附、增殖或分化，適合用作生物材料。而柞蠶絲素和天蠶絲素蛋白的氨基酸組成中分布著較多的促細胞黏附的RGD短肽（細胞特異性粘附識別信號）序列，用作細胞外基質(zhì)材料，應能提供更良好的細胞作用界面。為了系統(tǒng)地研究野蠶絲素蛋白序列-結(jié)構(gòu)-功能間的關(guān)系，尤

2、其是揭示野蠶絲素蛋白中與細胞功能密切關(guān)聯(lián)的序列結(jié)構(gòu)，我們對天蠶（柞蠶）絲素蛋白序列特征進行梳理，從基因水平上進行分子設計、采用大腸桿菌系統(tǒng)表達各種設計的基序或基序組合來加以研究。本文主要完成了一段含RGD肽段的重組表達，主要包括以下工作：
　　1、設計了編碼來自天蠶(柞蠶)絲素蛋白GSGAGGRGDGGYGSGSS即(-RGD-)1序列的基因AY1，采用基因重組技術(shù)克隆加倍至24倍的基因延伸片段AY24，通過瓊脂糖凝膠電泳及DNA

3、測序了驗證構(gòu)建的基因是正確的。
　　2、將AY1及各加倍基因插入pcDNA3.1B、pET-30a(+)及pGEX-KG三種系列的表達載體，分別在大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導表達。采用瓊脂糖凝膠電泳和DNA測序鑒定了各個表達載體構(gòu)建的正確性。經(jīng)篩選后確定pGEX-KG表達載體用來表達含RGD重組蛋白，通過SDS-PAGE電泳及Western blotting驗證了重組蛋白在大腸桿菌中成功獲得了表達。
　　3、探討了pGE

4、X-AY12和pGEX-AY24兩種表達載體分別表達的兩種融合蛋白GST-(-RGD-)12和GST-(-RGD-)24的最佳表達條件。采用親和層析柱純化得到了純度很高的兩種融合蛋白。通過SDS-PAGE電泳和Western blotting定性檢測表明：轉(zhuǎn)入pGEX-AY12的大腸桿菌在誘導劑IPTG濃度為0.5mmol/L下誘導6小時，融合蛋白GST-(-RGD-)12表達量達到最大值；轉(zhuǎn)入pGEX-AY24的大腸桿菌在誘導劑IPT

5、G濃度為1.0mmol/L，誘導6小時，融合蛋白GST-(-RGD-)24表達量達到最大值。進一步定量測定得：每升菌液可獲得GST-(-RGD-)12融合蛋白45mg左右；每升菌液可獲得GST-(-RGD-)24融合蛋白28mg左右。
　　4、采用Thrombin蛋白酶酶切融合蛋白GST-(-RGD-)12和 GST-(-RGD-)24獲得目的肽段(-RGD-)12和(-RGD-)24。通過Zeta電位測量與雙向電泳分析了目的肽段