魚腥藻PCC 7120中幾個(gè)固氮相關(guān)基因的功能驗(yàn)證.pdf

1、分 類 號(hào)：Q78 密 級(jí)： 碩 士 學(xué) 位 論 文 魚腥藻 PCC 7120 中幾個(gè)固氮相關(guān)基因的功能驗(yàn)證 黃 香 陽 第 一 指 導(dǎo) 教 師 ： 第 一 指 導(dǎo) 教 師 ： 何 平 副教授 第 二 指 導(dǎo) 教 師 ： 第 二 指 導(dǎo) 教 師 ： 學(xué) 院 名 學(xué) 院 名 稱： 生命科學(xué)學(xué)院 專 業(yè) 學(xué) 位 類 別 ： 專 業(yè) 學(xué) 位 類 別 ： 工程碩士 領(lǐng) 域 ： 域 ： 生物工程 答辯委員會(huì)主席： 答辯委

2、員會(huì)主席： 朱國輝 副教授 中國·廣州 2016 年 6 月 摘 要 魚腥藻 PCC 7120（Anabaena sp. PCC 7120）在細(xì)菌發(fā)育學(xué)和多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究中，是一種典型的模式生物。在缺乏化合氮源的環(huán)境中，絲狀體中的營養(yǎng)細(xì)胞能分化成為具有特殊結(jié)構(gòu)的異形胞。主要研究內(nèi)容如下：在實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)上，選擇可能與固氮有關(guān)的靶基因，利用 pZR606 敲除某一個(gè)

3、靶基因，觀察敲除菌株在不含有化合氮源上的培養(yǎng)條件下的表型變化，確定可能與魚腥藻 PCC 7120 細(xì)胞固氮相關(guān)的基因；選用含有 PglnA 強(qiáng)啟動(dòng)子的 pZR670 質(zhì)粒作為互補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒，構(gòu)建含有靶基因啟動(dòng)子序列的互補(bǔ)型表達(dá)質(zhì)粒， 觀察互補(bǔ)菌株是否在恢復(fù)一定的表達(dá)后能使細(xì)胞在缺少化合氮源的培養(yǎng)基上恢復(fù)生長，從而確定與固氮相關(guān)的基因；通過分析魚腥藻 PCC 7120的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選擇在缺氮和有氮條件下不同表達(dá)量的 sRNA，利用 pZR6

4、70 構(gòu)建干涉質(zhì)粒，通過三親接合轉(zhuǎn)移方法獲得干涉菌株，觀察干涉在培養(yǎng)過程中所引起的細(xì)胞形狀的變化，確定能引起魚腥藻 PCC 7120 細(xì)胞型狀改變的 sRNA 序列。 主要研究結(jié)果如下： 取生長狀態(tài)良好的魚腥藻 PCC 7120 細(xì)胞，接種于 AA/8 和 AA/8N 液體中培養(yǎng)，通過測(cè)量魚腥藻 PCC 7120 細(xì)胞在 700 nm 處的吸光度值， 觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)， 通過生長曲線分析，氮源是細(xì)胞生長的一種限制性因素，也是異形胞形成

5、的關(guān)鍵元素。 成功利用單交換基因重組技術(shù)，以 pZR606 質(zhì)粒為基本骨架，構(gòu)建了 all2022、all2676、 alr0834 基因的敲除質(zhì)粒 pHEP52、 pHEP34 和 pHEP55， 敲除了 all2022、 all2676、alr0834 基因，獲得了基因敲除菌株 Δall2022、Δall2676、Δalr0834，在不含有化合氮源的 AA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其生長變化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)此三種敲除菌株在不含化合氮源的培養(yǎng)基培

6、養(yǎng)條件下，魚腥藻 PCC 7120 在培養(yǎng)一段時(shí)間后均會(huì)變黃死亡。 成功利用表達(dá)質(zhì)粒 pZR670 構(gòu)建了 all2022、all2676、alr0834 基因的互補(bǔ)質(zhì)粒pHEP90、 pHEP91、 pHEP92， 通過三親結(jié)合轉(zhuǎn)移獲得其互補(bǔ)菌株▲all2022、 ▲all2676、▲alr0834，將獲得的互補(bǔ)菌株在不含有化合氮源的 AA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，▲all2676 和▲alr0834 在培養(yǎng)一段時(shí)間后能恢復(fù)生長，而▲all20