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文檔簡介
1、磷素是植物生長發(fā)育必需的元素之一,施用磷肥是確保糧食高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施。長期大量磷肥使用,導致土壤固定和土壤中磷素大量累積。溶磷微生物在土壤磷素循環(huán)中起著重要作用,將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷。篩選高效穩(wěn)定的溶磷菌株、深入開展溶磷和促生機理、以及克隆溶磷相關(guān)基因等研究,對溶磷微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應用具有重要意義。
本研究從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市鹽堿土中分離篩選了5株高效溶磷菌株,重點研究了日本曲霉M1和草酸青霉M2的溶磷能力、促生效果、溶
2、磷和促生機理。液體搖床條件下培養(yǎng)6d,以Ca3(PO4)2為磷源,菌株M1、M2的溶磷效果最優(yōu),有效磷達102089mg/L和971.87mg/L;以AlPO4為磷源,溶磷效果最佳的為菌株M1和M2,有效磷達995.69和987.74mg/L。菌株M1和M2分別接入含有5種磷礦粉培養(yǎng)液中,菌株M1和M2最高溶磷量分別為363.64mg/L和55583mg/L。盆栽試驗中,將M1、M2菌株各自制備的菌劑分別接種于3種磷源的4種土壤。結(jié)果顯
3、示,菌株M1、M2對玉米植株促生效果顯著,接種菌株M1、M2處理的玉米植株鮮重比CK提高2.14%~9091%、干重增加22.15%~268.28%,土壤有效磷提高21.81mg/kg~24.27mg/kg。菌株M1與4種土壤的適配性均高于對照菌株黑曲霉DSM821與斜臥青霉P83。
借助LC-MS方法,測定出日本曲霉菌M1和草酸青霉菌M2在磷酸三鈣、磷酸鋁和開陽磷礦粉培養(yǎng)液中,分泌的有機酸和植物激素。菌株M1、M2分別接入磷
4、酸三鈣、磷酸鋁和開陽磷礦粉3種難溶磷培養(yǎng)液中經(jīng)過6d培養(yǎng)均產(chǎn)生7種有機酸,其中草酸和檸檬酸含量最高,M1產(chǎn)生的草酸和檸檬酸含量分別為61616mg/L和41369mg/L,M2產(chǎn)生的草酸和檸檬酸含量分別為623.34mg/L和437.21mg/L;培養(yǎng)液均能檢測到吲哚乙酸(IAA)和玉米素,IAA含量為15.45~77.58mg/L,玉米素濃度為0.06~0.11mg/L。
通過SMART技術(shù),成功構(gòu)建出了日本曲霉M1和草酸青
5、霉M2的cDNA文庫。插入載體中的基因長度主要為1000-1500bp,通過藍白斑篩選重組率,菌株M1重組率為99.91%;菌株M2重組率為99.93%。菌株M1構(gòu)建文庫滴度為6.19×106cfu/mL,菌株M2構(gòu)建文庫滴度為6.43×106cfu/mL。
在草酸青霉M2構(gòu)建的cDNA文庫中,共篩選到64個具有溶磷能力的克隆子,在具有穩(wěn)定溶磷功能的克隆子中,通過測序獲得4條溶磷相關(guān)基因片段,分別命名為基因psf-p1、psf
6、-p2、psf-p3和psf-p4。4個溶磷相關(guān)基因的CDS全長分別為2427bp、1846bp、1161bp和1035bp;蛋白PSF-p1、PSF-p2、PSF-p3和PSF-p4分別含有681、483、251和80個氨基酸殘基。將4個溶磷基因和相應的蛋白序列分別在NCBI中進行比對,基因psf-p1與Penicillium decumbens strain114-2(KC1213141)相似性為99%、基因psf-p2與Penic
7、illium decumbens strain114-2(KC1213141)相似性為100%、基因psf-p3與Penicillium expansum strain HAD超家族水解酶(XM_0167445711)相似性為78%、基因psf-p4與Penicillium chrysogenum strain Wisconsin54-1255(XM_0025593411)相似性為74%。PSF-p1蛋白與草酸青霉114-2推定蛋白PD
8、E05949(EPS309951)相似性為99%,推定蛋白功能未知;PSF-p2蛋白與Penicillium decumbens胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶(AGC10824)相似性為99%,尚無溶磷功能報道;Psf-p3蛋白與草酸青霉的推定蛋白PDE_09609(EPS346451)相似性為99%,推定蛋白功能未知;PSF-p4蛋白在NCBI中完全沒有相似性蛋白序列。毫無疑問,本研究篩選得到的4條溶磷相關(guān)基因全部為新基因。
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