鯽魚血清中可溶性瘦素受體的檢測.pdf

1、瘦素(Leptin)是一種具有多種生理功能的神經(jīng)免疫內(nèi)分泌調(diào)節(jié)激素，由ob基因編碼，由脂肪組織分泌進(jìn)入血液，與一種短型受體結(jié)合后隨血液循環(huán)跨過血腦屏障進(jìn)入下丘腦，與特異性的瘦素受體(LPR)結(jié)合，通過激活某些特定的信號傳遞途徑來抑制進(jìn)食、增加能量消耗，此外還可通過與外周組織的瘦素受體(LPR)結(jié)合影響脂肪的分解合成和胰島素抵抗等一系列機(jī)體代謝過程。因此，LPR對進(jìn)一步發(fā)揮Leptin的生理功能起重要作用。Tartaglia LA于199

2、5年運(yùn)用表達(dá)克隆法首次從小鼠脈絡(luò)叢cDNA表達(dá)文庫中克隆出LPR，隨后在鳥類和兩棲動物中均已發(fā)現(xiàn)LPR。在硬骨魚類中，最早由Wong等在海洋青鳉中克隆了Leptin長型受體的cDNA序列。隨后，人們分別在河豚、日本青鳉、斑馬魚、大西洋鮭魚、石斑魚和黃顙魚中克隆了Leptin長型受體的完整編碼區(qū)，并從基因組定位、組織分布和發(fā)育表達(dá)調(diào)控等角度進(jìn)行了初步研究?？傮w而言，目前關(guān)于魚類瘦素受體的研究還很少。
　　首先提取鯽魚組織總RNA，通

3、過RT-PCR獲得Leptin基因，然后克隆到表達(dá)載體pGEX-4T-2中，在37℃、1 mM IPTG條件下誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)檢測大腸桿菌BL21(DE3)原核表達(dá)所得重組融合蛋白GST-Leptin以包涵體形式存在，表達(dá)量及可溶性幾乎不受IPTG濃度變化的影響，但對溫度的變化很敏感，隨溫度降低，表達(dá)量也大大減少。用8M尿素對包涵體進(jìn)行變性處理，同時采用稀釋復(fù)性和緩慢透析的方法使融合蛋白溶解，溶解的融合蛋白不能與GST Resin結(jié)合，可能

4、是其沒有完全恢復(fù)天然狀態(tài)的構(gòu)象。為此選擇了標(biāo)簽較小的表達(dá)載體pET32a(+)，經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)在溫度為25℃，IPTG濃度為0.1 mM時，重組融合蛋白Trx-Leptin可溶性表達(dá)，可以用于Pull-down檢測鯽魚血清中的可溶性瘦素受體(sLR)。
　　為了檢測鯽魚中的瘦素受體，根據(jù)鯽魚Leptin長型受體胞外區(qū)第203-216和第632-645氨基酸序列，合成2條多肽，定期免疫動物，抽取血液，獲得了相應(yīng)的多克隆抗體，純化后運(yùn)用E

5、LISA法檢測抗體滴度，經(jīng)檢測抗體符合要求，分別用Anti-LPR203-216和Anti-LPR632-645檢測鯽魚不同組織中瘦素受體的表達(dá)水平，其中Anti-LPR203-216幾乎檢測不到信號，可能是該抗體不適用于Western Blot檢測;Anti-LPR632-645檢測結(jié)果表明鯽魚肝臟中瘦素受體表達(dá)量明顯高于鰓和肌肉，且在肝臟中檢測到了瘦素受體的兩種亞型，分子量分別約為110kD和90 kD。
　　通過RT-PCR

6、獲得了鯽魚Leptin短型受體一種亞型的cDNA序列，與長型受體轉(zhuǎn)錄本相比，該短型受體轉(zhuǎn)錄本由于兩個內(nèi)含子未被剪切，導(dǎo)致其閱讀框在跨膜區(qū)之前提前終止，可能編碼Leptin可溶性受體蛋白(sLR)。Pull-down檢測發(fā)現(xiàn)鯽魚血清中存在該短型受體，分子量大約為115kD，比預(yù)期分子量大，推測sLR以糖蛋白的形式存在。多肽競爭性分析顯示，用多肽孵育后抗體檢測到的信號條帶明顯被抑制，證明抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合具有特異性。我們推測魚類與人類和嚙

7、齒類動物不同，可能存在一種可溶性瘦素受體形成的新機(jī)制——“內(nèi)含子滯留”，即在編碼瘦素受體跨膜區(qū)的外顯子上游有兩個內(nèi)含子滯留，提前引入一個終止密碼子，使閱讀框在到達(dá)跨膜區(qū)前被提前終止，編碼Leptin的可溶性受體，并能夠分泌到胞外，作為Leptin結(jié)合蛋白與Leptin結(jié)合。
　　目前在鯉形目魚類中尚沒有關(guān)于可溶性Leptin受體的報道，本研究對鯽魚Leptin可溶性受體的鑒定填補(bǔ)了魚類Leptin受體研究在這方面的空白，也可為魚類