食源性乳酸菌的安全性評價.pdf

1、乳酸菌與人類生活息息相關，作為發(fā)酵劑廣泛應用于酸奶、干酪、發(fā)酵香腸、果蔬制品、酒精飲料、青貯飼料等食品或飼料加工。同時，乳酸菌也是人類和動物腸道的正常菌群，發(fā)揮著重要的益生作用，如緩解乳糖不耐癥、調節(jié)腸道菌群平衡、提供營養(yǎng)物質、增強免疫力等。乳酸菌一般被公認為安全性菌株，研究表明，一些食源性乳酸菌中也出現(xiàn)了抗藥性，而且是多重抗藥性，甚至一些菌株攜帶的抗藥性基因通過基因的水平轉移傳播到其它乳酸菌甚至致病菌中，造成了潛在的危害。另外，隨著研

2、究的深入，出現(xiàn)了一些關于乳酸菌的負面報道，某些菌株可能產(chǎn)生有害代謝物。因此，有必要對食源性乳酸菌進行安全性評價。本文從以下四個方面展開研究。
　　 1.食源性乳酸菌產(chǎn)有害代謝產(chǎn)物能力的分析
　　 首先，從原料奶、傳統(tǒng)發(fā)酵乳、市售酸奶和藥品中分離得到了36株乳酸菌。分析了這些菌株產(chǎn)有害代謝產(chǎn)物酪胺、組胺、硝基還原酶和偶氮還原酶的能力，結果發(fā)現(xiàn)，8株菌可以產(chǎn)生酪胺，3株菌可以產(chǎn)生組胺，所有的菌株都不產(chǎn)硝基還原酶和偶氮還原酶。

3、
　　 2.食源性乳酸菌的抗生素抗性分析
　　 對36株菌的抗生素抗性進行分析。利用液體稀釋法測定常見抗生素，如氯霉素、紅霉素和四環(huán)素對這些菌株的最小抑制濃度，結果表明，大部分乳酸菌具有抗生素抗性，其中具有氯霉素抗性26株菌、紅霉素抗性8株菌、四環(huán)素抗性11株菌，14株菌具有多重抗性，只有10株菌對所使用的抗生素都敏感。利用PCR法分析其抗性基因，結果表明，2株腸球菌攜帶紅霉素抗性基因，1株還攜帶有2種四環(huán)素抗性基因te

4、t(M)和tet(L)。另外還有2株乳桿菌攜帶四環(huán)素抗性基因。利用濾膜接合實驗對抗性基因的轉移性能進行分析。發(fā)現(xiàn)屎腸球菌Enterococcus faecium KN9所攜帶的四環(huán)素抗性不能轉移到四環(huán)素敏感的腸球菌Enterococcus faecalis181中，但可以轉移到乳球菌Lactococcus lactis subsp.cremoris MG1614中，并得到了接合子Lactococcus lactis subsp.crem

5、oris MGKN9。
　　 3.E.faecium KN9抗藥性質粒pKN9的遺傳結構分析
　　 對E.faecium KN9攜帶抗性基因的轉移元件進行了分析。利用PCR和anchored PCR擴增轉移元件的全長序列。因為受體菌L.lactis MG1614來源于L.lactis MG1363，而L.lactis MG1363的全序列已經(jīng)公布，所以以接合子基因組為模板進行后續(xù)實驗，當PCR擴增得到的序列與L.lact

6、is MG1363的序列相同時，可以分析出移動元件的插入位置。經(jīng)過多輪PCR，得到了約16 kb的DNA片段，在這個片段兩側同時含有轉座酶，序列比對分析為同一轉座酶。根據(jù)轉座酶相鄰基因設計特異性引物，并以供體菌E.faecium KN9基因組為模板進行PCR，結果表明該轉移元件為13818 bp的質粒，命名為pKN9。利用ORF Finder和BLAST分析其序列，發(fā)現(xiàn)這個質粒含有15個ORF，其中包括2個四環(huán)素抗性基因tet(M)和t

7、et(L)和1個鏈霉素抗性基因，但缺失轉移基因mob。利用實時熒光定量PCR分析四環(huán)素抗性基因在不同四環(huán)素濃度時的表達情況，發(fā)現(xiàn)這個質粒上的四環(huán)素抗性基因tet(M)能被四環(huán)素誘導表達，而tet(L)是組成型表達。
　　 4.Lb.delbrueckii JSQM1對氯霉素的適應性抗性
　　 為了驗證在抗生素選擇壓力下，菌株是否會出現(xiàn)抗藥性。本研究將Lb.delbrueckii JSQM1在亞抑制濃度的氯霉素中傳代培養(yǎng)，

8、每100代檢測一次抗生素抗性，一直到500代，然后分析其生長曲線、pH變化曲線，并利用HPLC技術分析其發(fā)酵性能。結果發(fā)現(xiàn)菌株在不加抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)也能通過自發(fā)突變產(chǎn)生抗性，但沒有選擇壓力的情況下，抗性菌株會丟失，菌群的抗性會下降，而長期的抗生素選擇壓力能使菌株的抗性保持在較高水平，可見抗生素在抗性菌株的自然選擇過程中發(fā)揮了重要作用。最后獲得的菌株與空白對照和原始菌株相比，生長曲線、pH變化曲線沒有明顯變化，菌株對糖類的代謝能力和產(chǎn)