α亞麻酸對人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟影響的研究.pdf

1、未成熟卵體外成熟培養(yǎng)（IVM）是指從不孕患者體內(nèi)獲取未成熟卵子，通過模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞的成熟環(huán)境，將卵子體外培養(yǎng)至成熟，再通過體外受精-胚胎移植（IVF-ET）技術(shù)治療不孕癥的方法。人類IVM的第一次成功分娩至今已有20余年，隨著成功妊娠的不斷增加，IVM技術(shù)在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展迅速，給卵泡成熟障礙者尤其是多囊卵巢綜合征（PCOS）患者帶來了福音。然而目前發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞雖能在體外成熟、受精、卵裂、胚胎移植后成功妊娠，但仍存在體外成熟率、卵

2、裂率和妊娠率低等問題。在體外培養(yǎng)中，哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的調(diào)節(jié)受培養(yǎng)介質(zhì)的影響，為了提高未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟率和胚胎質(zhì)量，許多研究嘗試在體外培養(yǎng)體系中添加不同物質(zhì)改善培養(yǎng)微環(huán)境以提高卵母細(xì)胞體外成熟率和卵母細(xì)胞發(fā)育潛能。目前尋求最佳的培養(yǎng)體系，改善IVM治療結(jié)局，成為IVM技術(shù)的研究熱點(diǎn)。
　　在卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育過程中，線粒體的功能備受關(guān)注。線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)和線粒體代謝活性如何影響卵母細(xì)胞成熟、

3、受精和后續(xù)胚胎發(fā)育潛能仍不清楚。以往的許多研究表明mtDNA拷貝數(shù)在卵母細(xì)胞成熟和隨后的胚胎發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。人們認(rèn)為卵母細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)已成為評價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)。但有關(guān)mtDNA拷貝數(shù)對卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育潛能的影響仍存在不同結(jié)論。
　　α亞麻酸（ALA）是全順式9、12、15十八碳三烯酸，屬n-3系列多不飽和脂肪酸(PUFAs)。它是生物膜的重要組成成分之一，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為二十碳五烯酸（EPA）

4、和二十二碳六烯酸（DHA）發(fā)揮功能。ALA不僅能增加卵母細(xì)胞前列腺素E2（PGE2）和環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的合成，還能通過提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx)等抗氧化酶的活性，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和丙二醛（MDA）的生成，在一定程度上促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟。有關(guān)ALA對哺乳動(dòng)物未成熟卵母細(xì)胞IVM的研究和對卵母細(xì)胞線粒體的影響已有報(bào)道，但至今未見ALA對人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育影響的研究。我們的前期研究認(rèn)為，

5、添加成熟卵泡液可提高人未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟率、受精率和卵裂率，效果優(yōu)于添加激素組。故在此基礎(chǔ)上，本研究探討ALA對人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟和胚胎發(fā)育的影響。
　　目的:本實(shí)驗(yàn)觀察ALA對人卵母細(xì)胞體外成熟及其發(fā)育潛能的影響，同時(shí)通過測定體外成熟卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)和培養(yǎng)液中MDA含量和SOD總活力探討ALA對卵母細(xì)胞發(fā)育的可能作用機(jī)制。
　　材料和方法:本實(shí)驗(yàn)中未成熟卵母細(xì)胞均來自2014年10月～2015年10月于

6、鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖中心因男方因素行ICSI助孕的患者，均采用標(biāo)準(zhǔn)長方案促排卵，共收集423名患者的689枚未成熟卵母細(xì)胞。
　　第一部分收集273名患者的未成熟卵母細(xì)胞441枚，其中MI期卵母細(xì)胞179枚，GV期卵母細(xì)胞262枚。將MI和GV按相同的構(gòu)成比隨機(jī)分為5組，分別放入含不同濃度（0μM，10μM，50μM，100μM，200μM）ALA培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后觀察卵母細(xì)胞成熟情況。根據(jù)各組成熟情況用Real-time

7、 PCR方法分別對ALA50μM組和ALA0μM組成熟卵母細(xì)胞線粒體DNA拷貝數(shù)進(jìn)行測定。
　　第二部分收集150名患者的未成熟卵母細(xì)胞248枚，其中MI87枚，GV161枚。將MI和GV按相同的構(gòu)成比隨機(jī)分為3組進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)系統(tǒng)分別為：①50％基礎(chǔ)IVM培養(yǎng)液+50μM ALA+50%成熟卵泡液；②50%基礎(chǔ)IVM培養(yǎng)液+50%成熟卵泡液；③基礎(chǔ)IVM培養(yǎng)液。依次記為A、B、C組，培養(yǎng)24h后觀察卵母細(xì)胞成熟情況。對成熟的

8、卵母細(xì)胞行ICSI授精，后續(xù)觀察比較三組未成熟卵母細(xì)胞的成熟率、ICSI受精率、2PN卵裂率、可利用胚胎形成率和囊胚形成率等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。同時(shí)測定及比較三組成熟卵母細(xì)胞的IVM培養(yǎng)液中MDA含量和SOD總活力。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)處理均使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）或百分率(％)表示不同類型數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。多組比較滿足正態(tài)性和方差齊性的采用單因素方差分析，不滿足則采用K

9、個(gè)獨(dú)立樣本檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。多重比較按比較次數(shù)k適當(dāng)調(diào)整顯著性水平，α'=0.05/k，兩兩比較采用Bonferroni法，以P<α'為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　?。?）不同濃度（0μM，10μM，50μM，100μM，200μM）ALA體外培養(yǎng)未成熟卵母細(xì)胞，總24h成熟率以ALA50μM組（70.1%）最高，明顯高于ALA0μM組（42.1%）及

10、ALA200μM組（34.1%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）不同濃度（0μM，10μM，50μM，100μM，200μM）ALA體外培養(yǎng)MI期卵母細(xì)胞，24h成熟率兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（3）不同濃度（0μM，10μM，50μM，100μM，200μM）ALA體外培養(yǎng)GV期卵母細(xì)胞，24h成熟率以ALA50μM組(64.4%)最高，明顯高于ALA0μM組(28.9%)及ALA200μM組(18.2%)，差異

11、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　（4） ALA50μM組成熟卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)（3.64×107±1.85×106）大于ALA0μM組（3.42×106±1.95×105），差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　第二部分
　?。?）50μM ALA+成熟卵泡液組（A組）、成熟卵泡液組（B組）、對照組（C組）總24h成熟率依次為75.9%、57.3%、38.0%，A組高于B組且B組高于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）三組中

12、MI期卵母細(xì)胞24h成熟率分別為83.9%、78.6%、53.6%，A組成熟率高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組成熟率高于B組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組中GV期卵母細(xì)胞24h成熟率分別為71.4%、46.3%、29.4%，A組成熟率高于B組、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）三組卵母細(xì)胞ICSI后的受精率，兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組卵母細(xì)胞2PN卵裂率依次為92.3%、88.6%、57.9%，A、B組2PN卵裂率較C組高，差異

13、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組可利用胚胎率，兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；囊胚形成率依次為22.9%、16.1%、9.1%，兩兩相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但較對照組出現(xiàn)逐漸增高的趨勢。
　?。?）A組MDA含量低于B組及C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組間SOD總活力，兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1. ALA有利于人未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟，濃度以50μM最佳，且對GV期卵母細(xì)胞的成熟作用比對MI期卵母細(xì)胞作用更明顯。