新型聚乙二醇化葡激酶的制備及功能鑒定研究.pdf

1、目的：通過對葡激酶（SAK）基因序列進行定點突變、表達、純化與進行聚乙二醇修飾以獲得較高純度的聚乙二醇化葡激酶（peg-SAK-cys）,并對其溶栓活性與免疫原性初步進行驗證。
　　方法：設計引物將根據(jù)SAK晶體結構與預測抗原位點所挑選的82號氨基酸突變?yōu)榘腚装彼岵⑼蛔冑|粒通過化學轉化進入BL21(DE3)感受態(tài)。利用經(jīng)典原核表達技術表達突變葡激酶蛋白(SAK-cys)。利用鎳離子交換柱、分子篩等方法分離純化SAK-cys蛋白并

2、對其進行聚乙二醇修飾。用纖維蛋白平板溶圈法和血栓彈力圖初步對本次實驗制備的peg-SAK-cys與課題組以相同方法制備的另外4種peg-SAK-cys的生物活性進行驗證。以酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法評價這些peg-SAK-cys的免疫原性。分析體外實驗數(shù)據(jù)，并對功能評價較高的 peg-SAK-cys通過動物栓塞實驗模型進一步功能驗證。
　　結果：成功獲得了82號氨基酸突變的葡激酶質粒，表達、純化了突變蛋白，并進行聚乙二醇修飾獲得

3、了第82號葡激酶突變的葡激酶蛋白（peg-SAK-C82A），分離純化后純度在總蛋白質量的90%以上。統(tǒng)計分析與計算溶圈實驗結果，第97號與104號氨基酸突變的聚乙二醇化葡激酶(peg-SAK-C97A、peg-SAK-C104G）保留了較高的活性；血栓彈力圖實驗數(shù)據(jù)也支持了這一結果；免疫原性測定結果提示peg-SAK-C104G的免疫原性顯著低于野生型SAK（P=0.0002）；評價peg-SAK-C104G對SD大鼠頸動脈栓塞模型的