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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
1. 建立銀杏葉提取物(GBE)血清藥理學(xué)研究方法;
2. 采用該方法研究GBE含藥血清對(duì)腎小球系膜細(xì)胞(MC)的作用;
3. 考察GBE中單體成分蘆丁和槲皮素對(duì)MC的作用。
方法:
第一部分:GBE血清藥理學(xué)方法的建立及其含藥血清對(duì)MC的作用
1.含藥血清的制備:正常SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、GBE高劑量組、GBE中劑量組、GBE低劑量組。連
2、續(xù)給藥,每日2次,于末次給藥后采血。無菌條件下分離血清,濾過后凍存。
2.大鼠MC的培養(yǎng):大鼠MC分為正常對(duì)照組、空白血清組、高糖模型組、低、中、高劑量含藥血清組、GBE對(duì)照組,體外常規(guī)培養(yǎng)。
3.MTT法確定體系中最佳空白血清添加量。
4.HPLC法結(jié)合藥效法確定最宜采血時(shí)間。
5.可見分光光度法測(cè)胞漿T-SOD、MDA、T-AOC三個(gè)抗氧化指標(biāo)的水平。
6.放射免
3、疫法測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)Ⅳ型膠原和層粘蛋白含量。
7.RT-PCR法測(cè)細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)。
8.HPLC法測(cè)GBE及其含藥血清指紋圖譜。
第二部分:GBE單體有效成分對(duì)MC的作用
1.大鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)。大鼠MC分為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、高糖模型組、GBE對(duì)照組、卡托普利對(duì)照組、低、高劑量蘆丁組、低、高劑量槲皮素組。
2.流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)細(xì)胞周期。
4、 3.放射免疫法測(cè)胞漿內(nèi)Ⅳ型膠原和層粘蛋白含量。
4.RT-PCR法測(cè)TGF-β1 mRNA表達(dá)。
5.免疫印跡法測(cè)Smad2/3、Smad7蛋白含量。
6.可見分光光度法測(cè)胞漿T-SOD、MDA兩個(gè)抗氧化指標(biāo)的水平。
結(jié)果:
第一部分:GBE血清藥理學(xué)方法的建立及其含藥血清對(duì)MC的作用
1.按人臨床用藥等效劑量的5倍,每日2次、連續(xù)4天灌胃給藥,于末次
5、給藥后2 h采血時(shí)大鼠血清中GBE各有效成分的含量最高。
2.體系中加入20%該條件下制備的含藥血清對(duì)MC細(xì)胞正常增殖沒有影響。
3.與高糖組相比,中、高劑量組含藥血清和GBE均可顯著提高M(jìn)C的抗氧化水平。高劑量組含藥血清的抗氧化能力略好于GBE。
4.與高糖組相比,GBE含藥血清中、高劑量組和GBE組的Ⅳ型膠原有顯著性下降;GBE高劑量含藥血清組和GBE組的Ⅳ型膠原的表達(dá)水平相當(dāng);GBE含藥血
6、清低中、高劑量組和GBE組的層粘蛋白有顯著性下降。
5.與高糖組相比,GBE含藥血清中、高劑量組和GBE組TGF-β1含量明顯降低,有顯著性差異。表明GBE含藥血清可以降低TGF-β1的表達(dá)。
6.在GBE及其含藥血清指紋圖譜中確定了蘆丁、槲皮素、槲皮苷和山奈酚四種單體成分,其中蘆丁和槲皮素是兩種主要成分。
第二部分:GBE單體有效成分對(duì)MC的作用
1.與高糖組相比,蘆丁低、高劑量
7、組和槲皮素低、高劑量組的G0/G1期均有顯著降低,不同劑量蘆丁組S期細(xì)胞比例有不同程度的升高;與正常組比較,槲皮素組S期細(xì)胞百分率降低,但G2/M期細(xì)胞比例增多,高劑量槲皮素可引起凋亡。
2.與高糖組相比,蘆丁和槲皮素低、高劑量組均可降低細(xì)胞內(nèi)Smad2/3蛋白的表達(dá),增加細(xì)胞內(nèi)Smad7蛋白的表達(dá);蘆丁高劑量組和槲皮素低、高劑量組層粘蛋白和Ⅳ型膠原的表達(dá)有顯著性降低,與高糖組相比皆有顯著性差異;蘆丁和槲皮素低、高劑量組的
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