骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合膠原—?dú)ぞ厶巧窠?jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見和嚴(yán)重的創(chuàng)傷并發(fā)癥之一。目前，受損神經(jīng)的再生及功能修復(fù)仍是一項(xiàng)尚未解決的臨床難題。對(duì)于短節(jié)段的神經(jīng)缺損，可直接將其端-端吻合，使近端再生的神經(jīng)纖維能夠穿過受損區(qū)長(zhǎng)入遠(yuǎn)端。但長(zhǎng)節(jié)段的神經(jīng)缺損，往往需要通過神經(jīng)移植術(shù)進(jìn)行治療。自體神經(jīng)移植仍然是目前治療長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，自體神經(jīng)移植受到很多因素限制，如：供區(qū)神經(jīng)來源不足，需要手術(shù)獲取供體神經(jīng)，繼發(fā)供體神經(jīng)支配區(qū)肢體部分功能喪失以及供受神經(jīng)在組織結(jié)構(gòu)等方

2、面不匹配等。因此，尋找能夠替代自體神經(jīng)移植的方法是目前周圍神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域亟待解決的難題。
　　隨著組織工程研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)，應(yīng)用組織工程學(xué)方法構(gòu)建組織工程神經(jīng)支架來橋接長(zhǎng)節(jié)段神經(jīng)缺損收到比較滿意的效果。隨著研究的不斷深入，越來越多的具有高仿真結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架被報(bào)道，然而，僅有少數(shù)關(guān)于復(fù)合種子細(xì)胞神經(jīng)支架試驗(yàn)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。
　　本課題選用膠原為主要原料，應(yīng)用冷凍干燥技術(shù)，構(gòu)建出在組成成分及內(nèi)部結(jié)構(gòu)等方面均與正常神經(jīng)高度相似

3、的具有軸向微管樣結(jié)構(gòu)的三維多孔支架材料。筆者又選用具有來源廣、易培養(yǎng)且具有多向分化能力等諸多優(yōu)點(diǎn)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與其復(fù)合。利用多種形態(tài)學(xué)及功能學(xué)的研究方法綜合評(píng)估該復(fù)合支架橋接大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損的修復(fù)效果，并與自體神經(jīng)移植及單純支架移植比較，結(jié)果證實(shí)其療效接近自體神經(jīng)移植并優(yōu)于單純支架移植。具體內(nèi)容如下：
　　第一部分：骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的：探究大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及生長(zhǎng)條件，為其與膠原-殼聚糖

4、神經(jīng)支架復(fù)合并修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)缺損奠定基礎(chǔ)。
　　方法：取體重約70g左右的SD大鼠，體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察原代、傳代及誘導(dǎo)分化細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)改變，并描繪生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果：細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)并以細(xì)胞集落的方式增殖。培養(yǎng)至第3代的細(xì)胞呈分布均勻的紡錘形細(xì)胞生長(zhǎng)?？赏ㄟ^簡(jiǎn)單方法誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞及成骨細(xì)胞方向分化。
　　結(jié)論：培養(yǎng)至第3代的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有較高的細(xì)胞純度，且具有良好的干細(xì)胞分化活

5、性，可作為組織工程種子細(xì)胞應(yīng)用。
　　第二部分：膠原-殼聚糖神經(jīng)支架的構(gòu)建及其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的復(fù)合
　　目的：構(gòu)建一種組織工程神經(jīng)支架，并觀察體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在其內(nèi)部的生長(zhǎng)情況，為種子細(xì)胞的移植提供階段性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　方法：以Ⅰ型膠原蛋白和殼聚糖為原料通過冷凍干燥技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)支架，掃描電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)量其孔徑大小、孔隙率等指標(biāo)。將體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與Ⅰ型膠原蛋白-殼聚糖神經(jīng)支架復(fù)合，共培養(yǎng)3天；

6、掃描電鏡觀察細(xì)胞在支架內(nèi)部的生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：構(gòu)建出的神經(jīng)支架均為圓柱狀，內(nèi)部呈縱向平行排列的微管樣結(jié)構(gòu)，且孔徑均勻。細(xì)胞貼附在支架微管內(nèi)壁上，且生長(zhǎng)狀況良好。
　　結(jié)論：Ⅰ型膠原蛋白-殼聚糖支架具有良好的內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)和生物相容性，可與細(xì)胞復(fù)合后用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損。
　　第三部分：復(fù)合神經(jīng)支架修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的有效性評(píng)估
　　目的：利用體內(nèi)試驗(yàn)綜合評(píng)估復(fù)合神經(jīng)支架修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的有效性。
　　方

7、法：應(yīng)用免疫組織學(xué)、透射電鏡觀察、神經(jīng)電生理檢測(cè)、逆行示蹤標(biāo)記以及計(jì)算坐骨神經(jīng)指數(shù)等研究方法，從形態(tài)學(xué)和功能學(xué)兩方面綜合評(píng)估復(fù)合神經(jīng)支架修復(fù)大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損的效果。
　　結(jié)果：神經(jīng)支架在體內(nèi)能夠保持其完整結(jié)構(gòu)大約4周。復(fù)合支架材料組、單純支架材料組修復(fù)效果均接近自體神經(jīng)移植，復(fù)合支架材料組稍優(yōu)，有大量再生神經(jīng)纖維長(zhǎng)入遠(yuǎn)端。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，支架幾乎完全降解，并被大量再生神經(jīng)纖維替代（經(jīng)京尼平交聯(lián)后，本支架自發(fā)紅色熒光

8、）。修復(fù)段可見軸向微管間有NF160及S-100陽性的再生神經(jīng)纖維穿過，證實(shí)再生的神經(jīng)纖維通過了修復(fù)段。透射電鏡結(jié)果：新生的髓鞘比較纖細(xì)，結(jié)構(gòu)完整，有大量無髓神經(jīng)纖維和有髓神經(jīng)纖維共存，可觀察到板層結(jié)構(gòu)良好的髓鞘，再生神經(jīng)軸突情況良好，修復(fù)效果接近自體神經(jīng)移植。功能學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：復(fù)合支架組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、潛伏期和波幅與自體神經(jīng)移植結(jié)果接近，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；熒光金標(biāo)記后，觀察到陽性神經(jīng)元的數(shù)量在脊髓前角和背