953例重慶地區(qū)地中海貧血基因突變類(lèi)型分析

1、953例重慶地區(qū)地中海貧血基因突變類(lèi)型分析王歡，劉申，黃君富，徐莉，苗杰，張曉莉，府偉靈(400038重慶，第三軍醫(yī)大西南醫(yī)院檢驗(yàn)科)[摘要]目的了解重慶地區(qū)α與β地中海貧血(地貧)的基因突變類(lèi)型和頻率，預(yù)防地中海貧血患兒的出生減少出生缺陷。方法采用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreactionPCR)和反向斑點(diǎn)雜交(reversedotblotRDB)技術(shù)對(duì)1709例我院小細(xì)胞低色素貧血疑似地貧患者進(jìn)行地貧基因診斷分析。

2、結(jié)果1709例受檢者確診為地貧者953例其中α型地貧381例（1511例受檢）陽(yáng)性率為25.22%，包括SEAαα缺失295例(77.43%)α3.7αα缺失44例(11.55%)，α4.2αα缺失10例(2.62%)α3.7SEA15例（3.94%），α4.2SEA缺失2例(0.52%)α3.7α3.7缺失1例(0.26%)SEASEA缺失(Bart’s水腫胎)4例(1.05%)HbConstantSpring(HbCS)5例（1.3

3、1%）、HbQuongSze(HbQS)5例（1.31%）。β型地貧555例（1370例受檢），陽(yáng)性率為40.51%，其中CD4142(TCTT)基因類(lèi)型158例為最常見(jiàn)，CD17(A→T)154例和IVS2654(C→T)133例基因突變類(lèi)型略低于CD4142(TCTT)基因突變類(lèi)型。β地貧中雜合子共534例雙重雜合子20例，CD17純合子1例。α復(fù)合β地貧17例（1172例受檢）陽(yáng)性率為1.45%。結(jié)論初步闡明重慶地區(qū)人口中的α與β

4、地貧的基因突變類(lèi)型和頻率。應(yīng)加強(qiáng)重慶地區(qū)地中海貧血的篩查以減少地中海貧血患兒的出生。[關(guān)鍵詞]地中海貧血基因突變聚合酶鏈反應(yīng)反向斑點(diǎn)雜交[中圖法分類(lèi)號(hào)][文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[通信作者]府偉靈，Email:weilingfu@.cn張曉莉，Email:xlzhang227@.cn地中海貧血臨床上常見(jiàn)類(lèi)型有α地貧和β地貧兩種，目前還沒(méi)有有效的治療方法。對(duì)于α、β地貧造成的嚴(yán)重貧血只能依賴(lài)長(zhǎng)期輸血維持生命。應(yīng)用DNA分析技術(shù)對(duì)該病進(jìn)行早期產(chǎn)前診斷

5、和選擇性終止妊娠以防重癥患兒出生，是國(guó)際上公認(rèn)的首選辦法，有著重要的優(yōu)生學(xué)意義[12]。α、β地貧的分布基本一致主要分布在南方如廣東、廣西有較高的發(fā)病率[3]。在其他南方省份如云南、貴州、四川等省份也有一定的發(fā)病率。為了解重慶地區(qū)的地中海貧血分型，預(yù)防地中海貧血患兒的出生減少出生缺陷，本研究對(duì)2007年以來(lái)我院疑似病人進(jìn)行地中海貧血篩查和基因型分析現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)報(bào)告如下。1材料與方法1.1研究對(duì)象收集2007年5月至2011年6月本院住院

6、或門(mén)診患者1709例年齡1～42歲，男性450例，女性1023例，新生兒236例，主要為重慶市及周邊居民。其中收集血液標(biāo)本1287例患者有貧血癥狀或有地貧家族史，羊水186例臍血236例。1.2方法1.2.1地貧篩查采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血常規(guī)分析。國(guó)際地貧協(xié)會(huì)［2］推薦使用的地貧篩查診斷截?cái)嘀?cutoffvalues)是MCV＜79fL和MCH＜27pg，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室MCV取值較為廣泛，一般取值小于80fL［45］。1.2.2標(biāo)本

7、采集和制備TIANGEN試劑盒提取血液篩查陽(yáng)性者的EDTA2K2抗凝外周靜脈血、高風(fēng)險(xiǎn)胎兒的臍血或羊水、攜帶者分娩后的臍帶血DNA。1.2.3地貧基因診斷采用深圳益生堂生物企業(yè)有限公司生產(chǎn)的檢測(cè)試劑盒進(jìn)行。α地貧基因診斷:采取GapPCR方法診斷中國(guó)人常見(jiàn)的3種缺失型α地貧，即東南亞型(SEAαα)基因缺失、α3.7αα基因缺失和α4.2αα基因缺失。PCR反應(yīng)條件:96℃15min98℃45s→64℃90s→72℃90s，35個(gè)循環(huán)最

8、后72℃延伸7min取2～4μl的PCR產(chǎn)物在1.2%的瓊脂糖凝膠電泳紫外燈下觀(guān)察基因圖譜為1800、2000、1600、1300bp的條帶分別為α珠蛋白正常基因、α3.7型、α4.2型和SEA缺失型的擴(kuò)增產(chǎn)物。GapPCR和反向斑點(diǎn)雜交(RDB)法對(duì)α地貧基因突變進(jìn)行檢測(cè)包括3種α珠蛋白基因突變類(lèi)型[HbWS(CD122)CAC→CAG；HbQS(CD125)CTG→CCG；HbCS(CD142)TAA→CAA]。β地貧基因檢測(cè):采用

9、反向斑點(diǎn)雜交(ReversedotblotRDB)方法診斷中國(guó)人群中常見(jiàn)及稀少突變的共17種β地貧基因突變類(lèi)型包括:CD4142(TCTT)IVS2654(C→T)CD17(A→T)28(A→G)CD26(G→A)CD7172(A)CD43(G→T)29(A→G)起始密碼子ATG→AGGCD1415(G)CD2728(C)32(C→A)30(T→C)IVS11(G→T)IVS15(G→C)CD31(A→C)43to40(AAAC)。按照

10、操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。取DNA2μl加入反應(yīng)管中PCR條件:50℃15min95℃10min然后94℃60s→55℃30s→72℃30s經(jīng)35個(gè)循環(huán)最后72℃延伸5min。將擴(kuò)增產(chǎn)物與結(jié)合有中國(guó)人較常見(jiàn)的17種β地貧基因突變寡核苷酸探針的膜條進(jìn)行反向點(diǎn)雜交鑒定β地貧基因突變的類(lèi)型。非缺失型α地貧和β地貧通過(guò)雜交膜條斑點(diǎn)顯色特點(diǎn)確定基因型正常斑點(diǎn)全部顯色且無(wú)異常突變斑點(diǎn)同時(shí)顯色為基因型正常突變斑點(diǎn)及其相應(yīng)正常斑點(diǎn)同時(shí)顯色根據(jù)顯色突變斑點(diǎn)的基

11、因型確定為相應(yīng)基因型的地貧雜合子突變斑點(diǎn)顯色而相應(yīng)正常斑點(diǎn)不顯色為顯色突變斑點(diǎn)基因型地貧純合子。2結(jié)果2.11709例地貧檢測(cè)結(jié)果血常規(guī)篩查1709例疑為地貧患者，進(jìn)行PCR和RDB地貧基因診斷檢測(cè)檢出地貧基因者953例其中基因類(lèi)型分別為α地貧基因381例、β地貧基因555例、β和α地貧基因復(fù)合存在17例。斷除了做α缺失和β突變外還進(jìn)行α點(diǎn)突變的檢測(cè)有10例發(fā)生了α點(diǎn)突變，突變率0.66%。珠蛋白基因檢測(cè)是地貧的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳氨容^成熟、可

12、用于臨床診斷的實(shí)驗(yàn)技術(shù)有PCR擴(kuò)增結(jié)合凝膠電泳技術(shù)、膜反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)、DHPLC技術(shù)、液態(tài)懸浮點(diǎn)陣技術(shù)等[1316]這些技術(shù)雖然檢測(cè)特異性高但是都具有局限性有一定的適用范圍。PCR擴(kuò)增結(jié)合凝膠電泳技術(shù)常規(guī)僅用于對(duì)α缺失型地貧基因的檢測(cè)本研究應(yīng)用改良GapPCR多重檢測(cè)技術(shù)對(duì)α珠蛋白基因上SEA、α3.7和α4.2基因位點(diǎn)的缺失進(jìn)行了檢測(cè)。膜反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)和液態(tài)懸浮點(diǎn)陣技術(shù)屬于基因芯片技術(shù)范疇膜反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)以膜作為雜交載體，而液態(tài)

13、懸浮點(diǎn)陣技術(shù)是以熒光微球作為雜交載體[16]也被稱(chēng)為“液相芯片”具有雜交速度快、雜交反應(yīng)不需洗滌、對(duì)實(shí)驗(yàn)室污染少等優(yōu)點(diǎn)為較好的實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。但目前液態(tài)懸浮點(diǎn)陣技術(shù)只能對(duì)β地貧基因的8個(gè)常規(guī)突變點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。本研究應(yīng)用的膜芯片反向點(diǎn)雜交技術(shù)可進(jìn)行β地貧基因上17個(gè)位點(diǎn)突變和α地貧基因上αCS、αQS和αWS3種點(diǎn)突變類(lèi)型的臨床診斷是目前國(guó)內(nèi)檢測(cè)珠蛋白基因突變位點(diǎn)最多的芯片系統(tǒng)具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)被公認(rèn)為準(zhǔn)

14、確可靠的β地中海貧血的基因診斷方法[17]。DHPLC技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的一種高效、快速和準(zhǔn)確的核酸片段大小、點(diǎn)突變檢測(cè)技術(shù)該技術(shù)不需要雜交實(shí)驗(yàn)可用PCR產(chǎn)物直接檢測(cè)在幾分鐘內(nèi)出結(jié)果[1518]是一個(gè)很有潛力的技術(shù)平臺(tái)但是目前該技術(shù)只能對(duì)β地貧基因的8個(gè)常規(guī)突變點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。專(zhuān)家指出基因診斷是確診重型β地中海貧血的“金標(biāo)準(zhǔn)”但在采用反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)診斷地中海貧血時(shí)需注意“假陰性”。因此臨床診斷地貧要同時(shí)選擇檢測(cè)基因缺失和基因突變的方法對(duì)重

15、癥患者在基因未能明確診斷時(shí)應(yīng)在調(diào)查家族資料證實(shí)父母均為輕型地中海貧血的背景下采用基因測(cè)序技術(shù)加以診斷。參考文獻(xiàn)：[1]PeresMJCarreiroMHMachadoMCetal.NeonatalscreeningofhemoglobinopathiesinapopulationresidinginPtugal[J].ActaMedPt19969(46):135139.[2]ModellBHarrisRLaneBetal.Infmedc

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