第一節(jié) 種子制備

1、?第四章第四章種子制備與菌種保藏種子制備與菌種保藏?第一節(jié)第一節(jié)種子制備（種子制備（Inoculumdevelopment）定義：由保藏的菌種開(kāi)始，經(jīng)過(guò)逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最后獲得供生產(chǎn)車(chē)間發(fā)酵罐接種的的足夠數(shù)量和優(yōu)質(zhì)質(zhì)量的種子。生產(chǎn)菌種的必備條件：生產(chǎn)菌種的必備條件：1生長(zhǎng)快：2對(duì)環(huán)境條件要有比較大的承受能力3遺傳表現(xiàn)型要穩(wěn)定，不易退化4菌種要純幾個(gè)概念幾個(gè)概念種子罐級(jí)數(shù)種子罐級(jí)數(shù)：種子在種子罐中需擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)。發(fā)酵級(jí)數(shù)：發(fā)酵級(jí)數(shù)：種子罐

2、的級(jí)數(shù)加一。接種量接種量：放罐的種子罐的培養(yǎng)液體積除以接種后培養(yǎng)液的體積的百分?jǐn)?shù)。種齡：種齡：生產(chǎn)種子的培養(yǎng)時(shí)間。一斜面種子的制備斜面種子的制備1.斜面種子：斜面種子：在試管或扁瓶?jī)?nèi)，以瓊脂固化的培養(yǎng)基表面上生長(zhǎng)的菌種培養(yǎng)物。2.制備流程：制備流程：3.制備過(guò)程注意事項(xiàng)制備過(guò)程注意事項(xiàng)(1)瓊脂要完全浸沒(méi)在營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)用量1.0%2.5%(2)營(yíng)養(yǎng)液中最好不含易沉淀的固形物；(3)裝量掌握在斜面頂端不超過(guò)試管或扁平長(zhǎng)度的23；(4)滅菌后垂

3、直放置至稍冷后再斜放，以減少冷凝水(5)微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入3.質(zhì)量檢查質(zhì)量檢查(1)外觀檢查(2)無(wú)菌檢查(3)搖瓶生產(chǎn)能力檢查4.影響斜面種子質(zhì)量的因素影響斜面種子質(zhì)量的因素(1)原材料質(zhì)量，水質(zhì)，培養(yǎng)基pH，(2)滅菌條件，(3)接種量，(4)培養(yǎng)室溫度、濕度、通風(fēng)、(5)培養(yǎng)時(shí)間，(6)有害氣體或揮發(fā)物（培養(yǎng)室內(nèi)不要安紫外燈）(7)冷藏條件?二、米粒種子（米孢子）、米粒種子（米孢子）?1.米孢子：米孢子：

4、將霉菌或放線菌接種到滅菌后的大米或小米顆粒上，恒溫培養(yǎng)一段時(shí)間后產(chǎn)生的分生孢子。?2.米孢子制備工藝流程米孢子制備工藝流程?3.制備過(guò)程注意事項(xiàng)制備過(guò)程注意事項(xiàng)（1）浸泡時(shí)間及加營(yíng)養(yǎng)液量應(yīng)掌握在滅菌后米粒熟透但不粘連；（2）分裝量應(yīng)掌握在平鋪后有23粒米的厚度（3）米粒不要碰到瓶塞；（4）培養(yǎng)前期應(yīng)經(jīng)常搖動(dòng)米粒，使微生物在米粒表面生長(zhǎng)均勻，氣生菌絲及孢子長(zhǎng)成后不再搖動(dòng)。（5）保存：冰箱保存；真空干燥保存；10%20%甘油浸泡保存?4.質(zhì)

5、量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（1）無(wú)雜菌污染（2）孢子數(shù)足夠，發(fā)芽率高（3）生產(chǎn)能力高(4)真空干燥后含水量小于8%5.影響質(zhì)量的因素及控制影響質(zhì)量的因素及控制（同前）?三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同米粒種子）三、種曲（培養(yǎng)材料用麩皮、米糠等，其余同米粒種子）四、搖瓶種子四、搖瓶種子1.搖瓶種子搖瓶種子:將斜面種子或米孢子接種于錐形搖瓶?jī)?nèi)的液體培養(yǎng)基中，在搖床上振蕩培養(yǎng)得到的液體種子。2.制備流程制備流程:3.制備過(guò)程注意事項(xiàng)制備過(guò)程注意事

6、項(xiàng)?培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量應(yīng)較斜面豐富，以確保一定的營(yíng)養(yǎng)菌體生長(zhǎng)量；能保持生長(zhǎng)過(guò)程中pH穩(wěn)定。?培養(yǎng)基裝量適當(dāng)，以保證良好的通氣并與發(fā)酵罐通氣條件相適應(yīng)；參考裝量為4050ml250ml瓶，6080ml500ml瓶，90110ml750ml瓶，120150ml1000ml瓶；如果是厭氧培養(yǎng)，則裝量應(yīng)增加一倍以上；3)滅菌時(shí)要注意不要讓蒸汽冷凝水打濕或粘污培養(yǎng)基在瓶塞或紗布上4）注意搖床轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速越快，偏心距越大，通氣越好。經(jīng)常檢查，皮帶松弛

7、時(shí)要緊一緊。5）注意搖床中心與邊緣、上層與5070℃）12年?7冷凍干燥管保存（冷凍干燥管保存（lyophilizationfreezedrying)?收集菌種滅菌脫脂牛奶或馬血清作為懸浮介質(zhì)?滅菌安瓿管預(yù)凍真空凍干密封，?4℃冰箱，保存35年?適用于一切微生物的保存?細(xì)胞10%20%甘油作為懸浮介質(zhì)?分裝入無(wú)菌聚丙烯管預(yù)凍置液氮內(nèi)（196℃），?保存510年?適用于所有微生物、動(dòng)物和植物細(xì)胞的保存?8液氮管保存液氮管保存(stagei

8、nliquidnitrogen)?9、基因工程菌的保藏、基因工程菌的保藏?由載體質(zhì)粒等攜帶的外源由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需。復(fù)制子。質(zhì)粒基因通常為宿主細(xì)胞生長(zhǎng)非必需。?一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。一般情況下當(dāng)細(xì)胞丟失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。?當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于

9、攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的當(dāng)培養(yǎng)基中加入抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。?我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。第三章第三章滅菌滅菌(sterilizatio

10、n)滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過(guò)滅菌：指用化學(xué)或物理的方法殺滅或去除物料及設(shè)備中所有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝過(guò)程。程。第一節(jié)第一節(jié)滅菌的原理及方法滅菌的原理及方法一幾種常見(jiàn)的滅菌方法幾種常見(jiàn)的滅菌方法1化學(xué)物質(zhì)滅菌化學(xué)物質(zhì)滅菌原理：藥物與微生物細(xì)胞中的成分反應(yīng)，使蛋白原理：藥物與微生物細(xì)胞中的成分反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變質(zhì)變性酶失活。性酶失活。常用的滅菌劑常用的滅菌劑:使用范圍：使用范圍：器皿、雙手和實(shí)

11、驗(yàn)室、無(wú)菌室的環(huán)境滅菌，器皿、雙手和實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室的環(huán)境滅菌，不能用于培養(yǎng)基滅菌不能用于培養(yǎng)基滅菌2.輻射滅菌輻射滅菌原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。原理：利用高能量的電磁輻射與菌體核酸的光化學(xué)反應(yīng)造成菌體死亡。常用：紫外線、常用：紫外線、X射線和射線和γ射線。射線。?使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌使用范圍：用于室內(nèi)空氣及器皿表面滅菌?3干熱滅菌干熱滅菌?原理：利用高溫對(duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解

12、質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。原理：利用高溫對(duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物。?常用方法：灼燒和電熱箱加熱，常用方法：灼燒和電熱箱加熱，140180℃12小時(shí)小時(shí)?使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌使用范圍：玻璃及金屬用具及沙土管滅菌?4濕熱滅菌濕熱滅菌?原理：蒸汽冷凝放出大量潛熱，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變?cè)恚赫羝淠懦龃罅繚摕?，具有穿透力，且在高溫有水分條件下，蛋白質(zhì)易變性。性。?常用方法：常

13、用方法：水煮常壓滅菌：水煮常壓滅菌：100℃飽和蒸汽滅菌：一般飽和蒸汽滅菌：一般121℃，30分鐘分鐘?使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌使用范圍：培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌。?5過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌?原理：利用微生物不能透過(guò)濾膜除菌。原理：利用微生物不能透過(guò)濾膜除菌。?方法方法:0.01~0.45?m孔徑濾膜，孔徑濾膜，?使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。使用范圍：用于壓縮空氣、酶溶液及其他不耐熱化合物溶液除菌。?二.濕熱滅