大鼠足細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

1、大鼠足細胞的原代培養(yǎng)及鑒定賈苗，張益民，賴德源（中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院腎內(nèi)科，廣州510120）[摘要]目的目的建立一種重復性好、操作簡便的大鼠足細胞培養(yǎng)方法。方法方法取重量200~220g的健康雌性SD大鼠，無菌取腎后通過差異過篩法分別通過80、150、200目細胞篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上腎小球進行接種，利用植塊法將接種培養(yǎng)面向上放置，4.5h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來正常放置于37℃、5%C02的恒溫恒濕培養(yǎng)箱進行孵育。采用形態(tài)學觀察和細胞

2、間接免疫熒光技術(shù)，對足細胞進行鑒定，并用流式細胞儀進行足細胞純度分析。結(jié)果結(jié)果5d后可見絕大部分腎小球貼壁并有少許腎小球周圍有細胞爬出，7~8d可見所有腎小球周圍有大量細胞爬出，胰酶消化后傳代培養(yǎng)。形態(tài)學及特異性抗體WT1nephrin鑒定為足細胞。流式細胞儀分析細胞純度99%左右。結(jié)論結(jié)論3層篩網(wǎng)法分離大鼠腎小球，結(jié)合植塊法促進腎小球貼壁，可以簡單、高效地培養(yǎng)出原代足細胞，且具備足細胞生物學特性，且在操作簡單的情況下細胞產(chǎn)量、純度與國

3、外文獻報道的相當[關(guān)鍵詞]足細胞；細胞原代培養(yǎng)；大鼠[中圖法分類號]R322.61；R329.24[文獻標識碼]近年來隨著對腎小球疾病發(fā)病機制的深入研究發(fā)現(xiàn)足細胞損傷是導致其持續(xù)進展的關(guān)鍵細胞[1]，如微小病變腎病、局灶節(jié)段硬化腎病、膜性腎病和糖尿病腎病等。足細胞因為高度分化、結(jié)構(gòu)復雜、定位特殊，體外培養(yǎng)的方法一直以來都受到國內(nèi)外學者大量的關(guān)注并不斷的被改善。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和免疫磁珠分離技術(shù)的使用，國外已有實驗室成功建立了人[2]、鼠【

4、3】的條件永久性足細胞株，但由于所要求的技術(shù)較高，花費較多，增加了普遍應用的難度，因此本文旨在建立一種簡便可行、重復性好的大鼠腎小球足細胞的原代培養(yǎng)方法，為研究腎小球疾病的發(fā)病機制等提供一個實驗平臺。1材料與方法1.1實驗動物清潔級SD大鼠，雌性，體重200~220g。購買自中山大學實驗動物中心，實驗動物質(zhì)量合格證號：0051349，實驗動物使用許可證：SCXK（粵）20040011。1.2主要儀器與試劑超凈工作臺，無菌手術(shù)室，高級熒光

5、分析倒置顯微鏡，流式細胞儀，恒溫細胞培養(yǎng)箱，80、150、200目不銹鋼細胞篩網(wǎng)。DMEMF12培養(yǎng)液、ITS、青鏈霉素、FBS及胰酶EDTA均購自GIBCO（美國）公司，PBS(吉諾，中國)，兔抗大鼠nephrinWT1多克隆抗體（Abcam美國)，PI（碘化吡啶）和FITC標記山羊抗兔IgG購自武漢博士德公司。1.3大鼠腎小球足細胞原代培養(yǎng)1.3.1主要試劑的配制含有5%FBS的完全培養(yǎng)基500mL內(nèi)含有DMEMF12培養(yǎng)液465m

6、L，F(xiàn)BS25mL，ITS5mL，青鏈霉素5mL，于超凈工作臺內(nèi)配制。1.3.2大鼠腎小球的分離采用差異過篩法【46】分離腎小球，并進行適當改進：①于無菌動物實驗手術(shù)室內(nèi)脫頸處死大鼠后，固定在手術(shù)臺上，消毒腹部皮膚后，沿腹部前[基金項目]廣東省科技計劃項目（2007B011000009）[通信作者]賴德源，電話：（020）81332487正中線與臍水平線做十字切口，充分暴露腎臟后，用剪刀剪下雙側(cè)腎臟，并迅速放置于裝有預冷DMEMF12培

7、養(yǎng)液的無菌離心管中，并放于冰盒內(nèi)。將腎臟移入超凈臺中，去除腎臟外周脂肪組織，剝除完整腎包膜，用預冷的含有10%青鏈霉素的PBS液沖洗3次。②從腎門處將腎臟沿縱形長軸剖為兩半，可見紅色顆粒樣外觀的皮質(zhì)，用手術(shù)刀分離腎皮質(zhì)后將其轉(zhuǎn)移至80目細胞篩網(wǎng)中，剪碎成1~2mm3大小，用玻璃注射器針芯進行研磨至糜狀，邊研磨邊用裝有預冷的PBS的注射器進行沖洗，滴速要慢、輕，至糜狀物顏色發(fā)白似纖維結(jié)締組織，收集濾過液再通過150目篩網(wǎng)，用針芯在150目

8、篩網(wǎng)上輕輕研磨并用PBS不斷沖洗，最后將濾過液通過200目篩網(wǎng)，收集200目篩網(wǎng)上的腎小球。上述超凈臺內(nèi)的所有操作均在冰盒上進行。1.3.3腎小球的接種和培養(yǎng)將收集的腎小球離心5min1500rpm沉淀物中加入完全培養(yǎng)基2ml(2只大鼠)重懸，接種至3瓶75cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，并每瓶加入10ml完全培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)瓶使接種面向上放入37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育4.5h后將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來使其正常放置。1.3.4足細胞消化、傳代：腎

9、小球接種第5天少量的內(nèi)皮細胞已經(jīng)觀察不到，視野中為大量貼壁腎小球及從少數(shù)腎小球周圍爬出的細胞，此時首次換液，之后繼續(xù)培養(yǎng)，第78d后，用0.25%胰酶0.02%EDTA進行消化，將消化下來的產(chǎn)物通過200目篩網(wǎng)以去除腎小球，此時的腎小球主要包含系膜細胞，收集過濾液離心5min1500rpm完全培養(yǎng)基重懸，用血細胞計數(shù)板計數(shù)，按25cm2培養(yǎng)瓶：2.0105瓶，24孔板:3.0104孔的細胞密度接種，放入37℃、5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)

10、孵育。1.4大鼠腎小球足細胞的鑒定首次傳代后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)7d待細胞鋪滿瓶底后行細胞免疫熒光染色鑒定，期間每隔一天換液一次。經(jīng)20℃冷丙酮固定10min，PBS洗滌3次，每次5min，0.3%TritonX100破膜3~5minPBS洗滌3次，每次5min，5%BSA室溫封閉30min。加一抗（5%BSA稀釋1:1000)兔抗大鼠nephrinWT1多克隆抗體后4℃冰箱孵育過夜，陰性對照組僅加抗體稀釋液。第2天取出后PBS洗滌3次，每次

11、5min，然后加入FITC標記的熒光二抗（5%BSA稀釋1:30)37℃溫箱中心的呈多邊形鋪路石樣的細胞，另一種位于集落的最邊上，呈大的不規(guī)則形。多數(shù)學者普遍認為從無囊腎小球中爬出的細胞與體內(nèi)足細胞的表型相同為足細胞來源，大的不規(guī)則細胞為壁層上皮細胞轉(zhuǎn)化而來，而多邊形細胞的來源問題一直存在著爭議。部分學者認為它們來源于腎小球壁層，為壁層上皮細胞，因為：①腎小球分離培養(yǎng)時不可能完全去除鮑曼囊，②表型不同于體內(nèi)的足細胞而與壁層上皮細胞相似。

12、具有里程碑性意義的是1997年，Mundel[3]等通過連續(xù)性觀察原代培養(yǎng)的人和大鼠的足細胞發(fā)現(xiàn):①培養(yǎng)最初生長的多邊形細胞可以原位轉(zhuǎn)變成樹枝狀細胞，前者增生能力強，而后者無增生能力，胞體較大，呈樹狀分支，常見雙核。②從多邊形細胞向樹枝狀細胞轉(zhuǎn)變的過程中伴隨著細胞骨架結(jié)構(gòu)的重組。③兩種細胞均表達了足細胞特征性分子O乙酰神經(jīng)節(jié)苷酯和WT1。Mundel等的這些研究結(jié)果證實多邊形細胞和樹狀細胞均來源于足細胞，兩者代表了處于不同分化狀態(tài)的足細

13、胞，當足細胞從腎小球長出時丟失了其分化的表型，并且在長期的培養(yǎng)中又重新獲得，樹狀細胞更接近于體內(nèi)分化成熟的足細胞。基于此，隨著轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，Mundel[15，16]等人通過分離轉(zhuǎn)染了溫度敏感的SV40TAg的小鼠腎小球建立了條件永久性的足細胞株，也是目前國內(nèi)外使用最多的足細胞來源。但此種方法所需要的轉(zhuǎn)基因小鼠價格昂貴，來源困難，Shankl[17]報道這種細胞株很難有效的進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染進去的基因在改變生長環(huán)境時發(fā)生丟失，限制其推廣應

14、用。因此，研究原代培養(yǎng)的方法和技巧也顯得尤為重要和必要。我們在體外培養(yǎng)的過程中也發(fā)現(xiàn)了上述3種表型的細胞，按照Mundel的觀點，我們將3種細胞同時進行消化傳代，發(fā)現(xiàn)有囊腎小球細胞群最外圍的細胞很難消化下來，因此消化下來的細胞類型為兩種，待細胞生長成熟后行流式細胞儀檢測足細胞純度可達95%以上。另外，由于足細胞的復雜生物學特征，因此在培養(yǎng)過程中，我們發(fā)現(xiàn)以下問題值得特別關(guān)注：①第1次用完全培養(yǎng)基重懸腎小球時所加的液體量不能過多，一般以剛

15、好鋪滿培養(yǎng)瓶底面為宜，向培養(yǎng)瓶里加入培養(yǎng)基時注意方向，不能將接種的腎小球沖下來。因為植塊法本身即是讓組織在貼壁前不要接觸培養(yǎng)基，以免受液體的漂浮作用而難以貼壁。②接種4.5h后翻轉(zhuǎn)是我們根據(jù)本實驗中心的條件摸索出來最適于腎小球貼壁的時間段，我們分別觀察了2.5、3、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0h，發(fā)現(xiàn)4.5h的腎小球貼壁率最高。③文獻[18]報道系膜細胞從腎小球爬出的時間約為第7天。我們選擇腎小球接種7天后進行消化傳代，將含有

16、系膜細胞的腎小球過濾掉，將足細胞進行傳代。我們曾觀察發(fā)現(xiàn)，在第7天時如果不傳代，而繼續(xù)換液后培養(yǎng)，從腎小球中逐漸爬出長梭形的細胞，為系膜細胞，形態(tài)明顯不同于足細胞。參考文獻：[1]ShanklSJ:Thepodocyte’sresponsetoinjury:roleinproteinuriaglomerulosclerosis［J］.KidneyInt2006，69:21312147.[2]SaleemMAO’HareMJReiserJ

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