酵母菌的分離與純化

1、酵母菌的分離與純化土壤是微生物生活的大本營(yíng)，是尋早有重要應(yīng)用潛力的微生物的主要菌源。不同圖樣中各類微生物的含量不同，一般土壤中細(xì)菌數(shù)量最多，其次為放線菌和霉菌。放線菌一般在較干燥、偏堿性、有機(jī)質(zhì)較多的土壤中較多；霉菌在含有機(jī)質(zhì)豐富、偏酸性、通氣性較好的土壤中較多；酵母菌在一般土壤中的數(shù)量較少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果園土壤中數(shù)量多些。（一）菌源1土樣用無(wú)菌的采樣小鏟在橘樹(shù)果園中取土壤表層下1~10cm土壤10g，裝入滅菌的牛皮紙袋內(nèi)

2、。封好袋口，記錄取樣地點(diǎn)、環(huán)境及日期。圖樣采集后應(yīng)及時(shí)分離，飯不能立即分離的樣品，應(yīng)保存在低溫、干燥的條件下，以減少其中菌相的變化。2面肥（1）面粉500克，白酒100克，水250，和好靜置發(fā)酵就可以了。冬季10個(gè)小時(shí)。（2）在溫水中兌一點(diǎn)酒，倒入適量面粉拌勻后放入絕緣保溫盛器（陶瓷，砂鍋）中，用布將整個(gè)盛器蓋好置于溫度較高處，6小時(shí)后即成面肥。以上方法做出的面肥只能保存幾天，不宜放置太久。3水果果皮桔子和葡萄等的果皮上含有數(shù)量較多的酵

3、母菌，既可單獨(dú)作為菌源也可以和果園土壤作為混合菌源。（二）酵母菌的分離1制備菌懸液稱取菌源1g，加入盛有99ml無(wú)菌水或無(wú)菌生理鹽水并裝有玻璃珠的錐形瓶中。振蕩20min，即成102的菌源懸液。再一次稀釋成104、105、106三個(gè)稀釋度。2涂布法分離取融化并冷卻至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基，每皿分別傾注約12ml培養(yǎng)基到培養(yǎng)皿內(nèi)。注意，溫度過(guò)高易將菌燙死，皿蓋上冷凝水太多也會(huì)影響分離效果；低于45度培養(yǎng)基易凝固，平板高低不平

4、。呆平板冷卻后，用無(wú)菌移液管分別吸取上述已經(jīng)制好的菌源稀釋液104、105、106三個(gè)稀釋度菌懸液各0.1ml，依次滴加于相應(yīng)編號(hào)的豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基平板上。每個(gè)稀釋度做2~3個(gè)平行皿。左手拿培養(yǎng)皿，并用拇指將皿蓋打開(kāi)一縫，再火焰旁右手持無(wú)菌玻璃涂棒將菌液自平板中央均勻向四周涂布擴(kuò)散。注意，切忌用力過(guò)猛，這樣會(huì)將菌液直接推向平板邊緣或?qū)⑴囵B(yǎng)基劃破。3培養(yǎng)接種后，平版倒置于30度恒溫箱中，培養(yǎng)2~3天，觀察結(jié)果。4純化用接種環(huán)挑取單個(gè)單個(gè)

5、酵母菌菌落，在平板上四區(qū)劃線，培養(yǎng)后分離得到單個(gè)菌落。酵母擴(kuò)培方案酵母擴(kuò)培方案一、培養(yǎng)基制備一、培養(yǎng)基制備(一)麥芽汁培養(yǎng)基的配制麥芽汁培養(yǎng)基的配制1培養(yǎng)基成分新鮮麥芽汁一般為1015波林。2配制方法(1)用水將大麥或小麥洗凈，用水浸泡612h，置于15℃陰涼處發(fā)芽，上蓋紗布，每日早、中、晚淋水一次，待麥芽伸長(zhǎng)至麥粒的兩倍時(shí)，讓其停止發(fā)芽，曬干或烘干，研磨成麥芽粉，貯存?zhèn)溆?。K2HP040.1gKCl0.05gMgSO47H2O0.05

6、gFeS040.001g瓊脂1.52g蒸餾水100ml自然pH2配制方法(1)稱量及溶化量取所需水量約2／3左右加入到燒杯中，分別稱取蔗糖、NaNO3、K2HP04、KCl、MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每100ml培養(yǎng)基加入1ml0.1％的FeS04溶液。（2）定容候藥品全部溶解后，將溶液倒入量筒中，加水至所需體積。（3）加瓊脂加入所需量瓊脂，加熱融化，補(bǔ)足失水。(4)分裝、加塞、包扎。(5)高壓蒸汽滅菌100Pa滅菌20min

7、。YPDYPD培養(yǎng)基培養(yǎng)基YPD或YPED，：YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基，加入瓊脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌的培養(yǎng)配方：1%YeastExtract（酵母膏），2%Peptone（蛋白胨），2%Dextrose(glucose)（葡萄糖），若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉配制方法：1溶解10gYeastExtract（酵母膏）20gPep

8、tone（蛋白胨）于900ml水中，如制平板加入20g瓊脂粉2高壓121度20min3加入100ml10Dextrose(glucose)（葡萄糖），(葡糖糖溶液滅菌后加入)注：葡萄糖，yeastextractpeptone溶液混合后在高溫下可能會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分變化，所以要分別滅菌后再混合。YPEG：除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作為碳源外，其他成分同YPD二、接種操作二、接種操作【器具】：酒精燈、酒精棉、剪刀、接種針