H3N2亞型豬流感病毒生物學(xué)特性和HA、NA、NS基因特性的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)對(duì)2004年廣東省部分地區(qū)出現(xiàn)呼吸道癥狀的豬群或病死豬的鼻拭子和病變肺臟進(jìn)行了豬流感病毒(SIV)的分離鑒定。所采病料勻漿滅菌，接種SPF雞胚擴(kuò)增培養(yǎng)并且傳代，收獲雞胚尿囊液。利用豬流感標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑，用血凝和血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)病毒并且鑒定分離毒株病毒亞型為H3亞型SIV。對(duì)所分離到的6株H3亞型SIv分離株進(jìn)行了生物學(xué)特性測(cè)定，分離毒株紅細(xì)胞凝集譜廣泛，血凝素對(duì)熱不穩(wěn)定，對(duì)雞胚表現(xiàn)較高的致病性，能夠感染小白鼠并表現(xiàn)典型的呼吸道癥狀和

2、眼觀病變。 應(yīng)用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)分析軟件設(shè)計(jì)H3N2亞型SIV HA、NA、NS、NSl基因片段的特異性PCR引物。分別從6株H3亞型SIV分離株感染的SPF雞胚尿囊液中直接提取核酸。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法擴(kuò)增各個(gè)毒株的HA、NA、NS基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)分離純化后克隆到pMD 18-T載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定純化后再送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，然后應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行

3、序列的拼接、序列信息編輯和分析。同時(shí)從GenBank中下載了H3N2亞型豬流感各時(shí)間和地域的代表株，分析6個(gè)毒株3個(gè)基因片段的核苷酸和氨基酸的序列，以闡明廣東地區(qū)H3N2亞型SIV分離株的基因來(lái)源和遺傳衍化規(guī)律。結(jié)果6個(gè)病毒同源性很高，在HA裂解位點(diǎn)處的氨基酸序列均為PEKQTR*G，不屬于高致病性流感病毒。它們的3個(gè)基因與1999年以后香港豬群中流行的流感和2000年以后北美流行的H3N2亞型流感毒株關(guān)系密切。 根據(jù)序列分析結(jié)

4、果選擇其中一個(gè)SIV分離株進(jìn)行非結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組質(zhì)粒pMDl8 T-NS中的NSl基因片段的亞克隆。再將其插入表達(dá)載體pET 28a中進(jìn)行基因重組和大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建出了H3亞型SIV NSl基因的重組表達(dá)載體，初步建立了NSl基因在大腸桿菌的表達(dá)條件。為NSl基因蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及其下游工作做好了準(zhǔn)備。 總之，本研究系統(tǒng)地闡明了目前廣東地區(qū)H3N2亞型SIV分離株的生物學(xué)特性、基因來(lái)源、分子遺傳衍化情況和NSl基因的表