目標(biāo)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)

1、目標(biāo)產(chǎn)品的蛋白質(zhì)分析檢測(cè)技術(shù)與質(zhì)量控制,曹純潔,2,主要內(nèi)容,蛋白質(zhì)含量和純度氨基酸的分析蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)肽譜蛋白質(zhì)突變點(diǎn)的分析蛋白質(zhì)的二硫鍵的分析,3,一、蛋白質(zhì)含量和純度,蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的方法：凱氏定氮法（繁瑣）、TCA比濁法、雙縮脲法（需樣品量大,不夠靈敏）、福林-酚法和紫外線法。已知摩爾消光系數(shù)時(shí)，可準(zhǔn)確的計(jì)算出蛋白濃度：公式A=εCL。 L為內(nèi)徑。C為摩爾濃度。摩爾消光系數(shù)（ ε ）的定義為：在

2、特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.00cm時(shí)，通過(guò)所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00 mol/L時(shí)的吸光度。 未知摩爾消光系數(shù)時(shí)，可測(cè)280nm和260nm光吸收值，用公式蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.55A280-0.76A260 =1.45A280-0.74A260,4,考馬斯蘭G-250法：此試劑在酸性條件下與蛋白反應(yīng)，當(dāng)吸收峰由465nm轉(zhuǎn)移到595nm，靈

3、敏度高，測(cè)定蛋白的濃度范圍廣。遺傳工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)的純度要求：95%、99%、99.9%。常用鑒定蛋白純度的方法：聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-PAGE、毛細(xì)管電泳（CE）、等電聚焦（IEF）、HPLC（包括凝膠過(guò)濾、各種反相HPLC、離子色譜、疏水色譜）,5,五種蛋白質(zhì)測(cè)定方法比較,6,新的方法：如質(zhì)譜法，僅pmol的樣品就能測(cè)定，同時(shí)能給出分子量。注意：只用一種鑒定蛋白純度的方法是不夠，往往幾種 （方法，機(jī)理）結(jié)合使用。,7,二、

4、氨基酸分析,檢測(cè)法的種類：氨基酸進(jìn)行UV檢測(cè)只能利用羧基（-COOH）在200～210nm處的吸收。一部分具有苯環(huán)的氨基酸也可在250～280nm檢測(cè)，但是，一般對(duì)原物質(zhì)（氨基酸）進(jìn)行高靈敏度、良好選擇性的分析比較困難。 因此，很早以來(lái)就使用衍生法，利用許多氨基酸構(gòu)造中存在的氨基（-NH2，-NHR），使用與該基團(tuán)可進(jìn)行選擇性反應(yīng)的衍生試劑。檢測(cè)的儀器：HPLC或氨基酸分析儀,8,兩類方法：柱后反應(yīng)法：將游離的氨基酸經(jīng)色譜柱分

5、離后，氨基酸再與顯色劑（茚三酮[吸光度檢測(cè)]、熒光胺、鄰苯二甲醛[熒光檢測(cè)]）作用，然后導(dǎo)入檢測(cè)器。優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)可自動(dòng)化，定量定性、重現(xiàn)性優(yōu)異。由于反應(yīng)前試樣成分在柱中分離，“雜質(zhì)”被去除，比較穩(wěn)定。,9,柱前衍生法： 將各種氨基酸和熒光試劑先作用生成衍生物，再分離，直接檢測(cè)衍生物的熒光。特點(diǎn)：反應(yīng)系統(tǒng)小，試劑用量少。可使用高價(jià)格的試劑，低背景，可提高靈敏度。即使檢測(cè)出未反應(yīng)試劑，但經(jīng)柱分離，也不會(huì)影響檢測(cè)。,10

6、,氨基酸水解方法：通常是5.7mol/L HCl真空狀況下110℃水解24h，也有在150 ℃下快速水解4h。不同條件下，各種氨基酸的回收有所不同，且有的氨基酸會(huì)遭受破壞（如色氨酸）。保證氨基酸分析準(zhǔn)確性的方法：過(guò)去用胰島素為標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)判斷，近年來(lái)采用“測(cè)試肽法”，即將20種常見(jiàn)氨基酸人工合成一個(gè)20肽。然后水解，每種氨基酸殘基出現(xiàn)頻率是1，易于校正回收。,11,新的方法：毛細(xì)管電泳，僅需ng的量，分辨率和準(zhǔn)確性均比SDS-

7、PAGE好。質(zhì)譜，靈敏度和準(zhǔn)確性都很好，精確度達(dá)0.01%。,12,13,三、蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定,早期方法：超離心、光散射法，需較高級(jí)儀器和較多的樣品，現(xiàn)很少使用。凝膠過(guò)濾法測(cè)蛋白質(zhì)分子量。如Sephadex系列（G75、G100）等——HPLC凝膠過(guò)濾系統(tǒng)。測(cè)定是完整蛋白質(zhì)分子量。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法：SDS-PAGE，用量約1ug，誤差為5-10%，但方便。測(cè)定蛋白質(zhì)亞基的分子量。,14,毛細(xì)管等電聚焦電泳-電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（CIEF

8、-MS）：分辨率極高，能分辨的等電點(diǎn)差異小于0.04pH。一些標(biāo)準(zhǔn)樣品用此法分析可發(fā)現(xiàn)亞型（分子量完全一樣，等電點(diǎn)不同）的存在。如細(xì)胞色素C兩個(gè)亞型分別為9.60、9.55。一般的方法根本無(wú)法分辨。,15,四、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn),等電聚焦法：可以測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，同時(shí)可鑒定蛋白的純度。毛細(xì)管等電聚焦法：能測(cè)定偏堿性的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，如天花粉蛋白的等電點(diǎn)測(cè)定。,16,五、肽譜,肽譜技術(shù)：是指蛋白質(zhì)被酶解或化學(xué)降解后肽段的分離分析或制備

9、。1、裂解方法：用酶或化學(xué)法裂解蛋白質(zhì)成肽段。 酶解：胰蛋白酶（切堿性氨基酸如Arg,lys的C端）Lys-C內(nèi)肽酶只作用于Lys-X鍵；梭菌蛋白酶只作用于Arg-X鍵。V8蛋白質(zhì)只專一作用于負(fù)電性氨基的C端（Glu,Asp）；在pH=4條件下，V8只作用于Glu-X鍵。,17,化學(xué)裂解：最常用的是溴化氰，作用于Met C端和其次一個(gè)AA的肽鍵。如γ-干擾素有4個(gè)Met，可被裂解成5肽段。BNPS-3甲基吲哚、N-氯代琥

10、珀酰亞胺作用于Trp-X鍵上；2-硝基-5硫氰基苯甲酸作用在X-Cys鍵上；羥胺作用在Asn-Gly鍵上。,18,,2、肽譜分析肽譜分析一般用HPLC和CE來(lái)進(jìn)行：HPLC主要是用RP-HPLC根據(jù)肽的長(zhǎng)短和疏水性來(lái)分離。當(dāng)肽親水性強(qiáng)，用HPLC不能帶留在柱內(nèi)，達(dá)不到分辨效果；或當(dāng)肽疏水性很強(qiáng)，粘在柱上洗不下來(lái)時(shí)，可用CE來(lái)進(jìn)行。SDS-PAGE：當(dāng)裂解成的肽段較大時(shí)，可進(jìn)行。當(dāng)對(duì)于小分子肽時(shí)，往往無(wú)法分辨。質(zhì)譜分析蛋白

11、質(zhì)的酶解產(chǎn)物，多肽出現(xiàn)先后按分子量大小排列。,19,六、蛋白質(zhì)突變點(diǎn)的分析,例子：人白細(xì)胞介素-2的突變點(diǎn)分析。133AA，第125是一游離Cys，第58位和第105位半胱氨酸形成二硫鍵（活性必需）。鑒定IL-2的蛋白質(zhì)工程(Cys-Ser/Ala)突變點(diǎn)：用TPCK-胰蛋白酶水解后，進(jìn)行RP-HPLC分離分析。天然IL-2和新型IL-2的酶解圖譜比較尋找有差別的肽進(jìn)行順序分析；熒光標(biāo)記Cys殘基，比較標(biāo)記前后新型IL-2酶解圖譜

12、的差別，從而鑒別出點(diǎn)突變的肽；同位素標(biāo)記法；利用IL-2只有一個(gè)色氨基酸，280nm主要是色AA吸收其次是酪AA和苯丙氨酸，酶解后分別用214nm和280nm檢測(cè)，可找到含色AA的肽段——用CE確定為均一——AA序列分析——證實(shí)新型IL-2的Ser（125）取代了Cys。,20,酶解后，用液質(zhì)分析，尋找與理論值分子量不一致的肽段。,21,新的方法：CE-MS聯(lián)機(jī)來(lái)檢測(cè)IL-2突變點(diǎn)，更快速和準(zhǔn)確。,22,七、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析,二硫

13、鍵的錯(cuò)配，生物活性只有原來(lái)的1/400。分析方法：IL-2（3個(gè)Cys）：用同位素標(biāo)記，pH=8.5用3H-碘代乙酸處理IL-2，只有游離的巰基才與其作用，然后還原，再用14C-碘代乙酸烷化。故如3H-標(biāo)記僅在肽11上，14C-的放射性全在肽12和肽14上，則和天然結(jié)構(gòu)是一致的。SOD（3個(gè)Cys）:可用同樣的方法。直接分析二硫鍵的異構(gòu)物。IL-2在堿性條件下形成二硫異構(gòu)體（58與125位或105與125形成二硫鍵），反相色譜中