胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)標(biāo)志物的初步篩選及其功能研究.pdf

1、胃癌發(fā)病率在我國(guó)很高，死亡率居惡性腫瘤之首。胃癌的主要治療手段是胃癌根治術(shù)，術(shù)后5年生存率為大概為32％～40％，其中約30％～50％的患者發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的過(guò)程為：癌細(xì)胞浸透胃漿膜，向腹腔脫落，進(jìn)而與腹膜粘附著床，增殖形成癌結(jié)節(jié)。轉(zhuǎn)移病灶一旦形成，治療十分困難。近年來(lái)提出了惡性腫瘤微轉(zhuǎn)移概念，即腫瘤細(xì)胞散播并存活于腹腔、淋巴結(jié)、外周血及骨髓及其他各組織器官中，卻又尚未形成轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。根據(jù)這一概念，在術(shù)

2、前或術(shù)中檢出脫落的癌細(xì)胞，進(jìn)而采取有效的阻斷治療，成為提高療效的關(guān)鍵。 腹腔沖洗細(xì)胞學(xué)(peritoneal lavage cytology，PLC)檢查是目前常規(guī)用于腹腔脫落癌細(xì)胞檢測(cè)的方法，但其缺點(diǎn)是對(duì)微量癌細(xì)胞檢測(cè)敏感性低，陽(yáng)性率僅為14％～21％，有較高的漏診率。 胃癌細(xì)胞脫落入腹腔后，其在腹腔內(nèi)的生物學(xué)活動(dòng)導(dǎo)致許多特異性分子的產(chǎn)生，因此能夠檢測(cè)到這些特異性分子的存在就證明了腹腔中腫瘤細(xì)胞的存在。 有鑒于

3、此，許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用各種分子生物學(xué)方法在胃癌患者的腹腔沖洗液中檢測(cè)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)的特異性分子，以期提高脫落癌細(xì)胞的檢出率。研究對(duì)象主要集中在腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原、細(xì)胞外基質(zhì)及相應(yīng)的降解酶類、粘附分子與細(xì)胞因子等。但各種研究結(jié)果并不一致，究竟何種分子指標(biāo)能夠切實(shí)有效的提高脫落腫瘤細(xì)胞的檢出率，目前尚無(wú)法達(dá)成共識(shí)。 在各種分子生物學(xué)檢測(cè)方法中，RT-PCR方法具有較高的靈敏度，從而使得胃癌腹腔微轉(zhuǎn)移檢測(cè)成為可能。 本研究從上

4、述問(wèn)題出發(fā)，選取與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的8種分子生物學(xué)檢測(cè)標(biāo)志物，分別為癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、肝素酶(heparanase，HPA)、多巴脫羧酶(dopa decarboxylase，DDC)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)、細(xì)胞角蛋白20(c

5、ytokeratin 20，CK20)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、磷酸絲氨酸磷脂酶(L-3-phosphoserine phosphatase，L-3-PP)，用RT-PCR方法對(duì)92例胃癌患者的腹腔沖洗液進(jìn)行并行檢測(cè)，對(duì)上述標(biāo)志物進(jìn)行初步篩選，以期找出提高脫落腫瘤細(xì)胞檢出率的理想指標(biāo)，用以進(jìn)一步指導(dǎo)臨床的診斷治療。 材料與方法： 1、標(biāo)本采集選取中

6、國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科2005～2006年間胃癌患者的腹腔沖洗液標(biāo)本92例。腹腔液標(biāo)本靜置5分鐘后，以2000 r/min離心10min，取部分沉渣HE染色、細(xì)胞學(xué)檢查；其余沉渣深低溫冰箱凍存，用于提取總RNA。胃癌原發(fā)病灶的侵襲深度、漿膜類型、大體類型、生長(zhǎng)方式等臨床病理因素按13版日本胃癌病理規(guī)約標(biāo)準(zhǔn)判定。 2、提取腹腔沖洗液總RNATRIZOL法提取胃癌腹腔沖洗液沉渣標(biāo)本中的總RNA。取少量RNA用于含量及純度測(cè)定

7、，其余分裝后置-70℃保存。 3、 RT-PCR擴(kuò)增各個(gè)分子mRNA (1)cDNA第一鏈合成用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。 (2)PCR擴(kuò)增各個(gè)指標(biāo)cDNA引物序列利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)，β-actin做內(nèi)對(duì)照。 (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，用安萊圖像分析儀掃描和Chemilmager5500軟件分析半定量。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用軟件SPSS11.5分析

8、，選用x<'2>檢驗(yàn)和方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、 RT-PCR與PLC檢查結(jié)果92例胃癌腹腔沖洗液中，CEA mRNA陽(yáng)性率為65.2％(60/92)，HPA mRNA陽(yáng)性率為58.7％(54/92)，DDC mRNA陽(yáng)性率為62.0％(57/92)；TGF-β1 mRNA陽(yáng)性率為35.9％(33/92)，MMP-7 mRNA陽(yáng)性率為39.1％(36/92)，CK20 mRNA陽(yáng)性率為42.4％(39/92)

9、，bFGF mRNA陽(yáng)性率為48.9％(45/92)，L-3-PP mRNA陽(yáng)性率為23.9％(22/92)；PLC陽(yáng)性率為25％(23/92)。而10例良性疾病腹腔沖洗液中均未檢測(cè)到這8種標(biāo)志物的mRNA。 8種標(biāo)志物中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的陽(yáng)性率明顯高于TGF-β1 mRNA、Mvn-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA和L-3-PP mRNA這5種標(biāo)志物以及PLC檢查(P<

10、0.05)，顯示了較好的敏感性。而TGF-β1 mRNA、MMP-7 mRNA、CK20 mRNA、bFGF mRNA、L-3-PP mRNA與PLC檢查相比，雖有增高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 在浸潤(rùn)深度為透漿膜層和漿膜層外的21例中， CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表達(dá)陽(yáng)性率分別為95.2％、90.5％、90.5％；PLC結(jié)果陽(yáng)性的23例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA

11、的表達(dá)陽(yáng)性率分別為95.7％、87.0％、91.3％；肉眼腹膜轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的13例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA陽(yáng)性表達(dá)的比例分別為100％、923％、100％，也顯示了較好的敏感性。 在浸潤(rùn)深度為粘膜層、粘膜下層和肌層的29例中，CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA的表達(dá)特異性分別為86.9％、86.9％、93.1％，說(shuō)明其具有較好的特異性。 2、 CEA mRNA、HPA mRN

12、A、DDC mRNA的表達(dá)與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移相關(guān)臨床病理因素比較胃癌腹腔液中CEA mRNA、HPA mRNA、DDC mRNA表達(dá)相對(duì)值隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的增加而顯著增加，亦隨著漿膜類型的惡變而有顯著增加(P<0.05)。另外CEA mRNA和DDC mRNA的表達(dá)還與胃癌生長(zhǎng)方式有關(guān)，浸潤(rùn)型生長(zhǎng)要明顯高于限局型生長(zhǎng)(P<0.05)。CEA mRNA的表達(dá)還與胃癌的大體類型相關(guān)，Borr3+Borr4型要高于Borr1+Borr2型(P<0