王不留行、黃芪對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外增殖與分泌功能影響的研究.pdf

1、本論文研究了中草藥黃芪、王不留行對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外增殖和乳蛋白合成的影響，并對(duì)其具體機(jī)制作了初步探索。首先建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)出具有正常生理功能的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并以該細(xì)胞系為模型，篩選對(duì)乳腺細(xì)胞體外生長(zhǎng)有促增殖效應(yīng)的中草藥，確定其適宜的作用濃度和作用時(shí)間，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究中草藥王不留行、黃芪對(duì)乳腺細(xì)胞一系列生物活性的影響及其作用機(jī)理。 本研究包括五個(gè)部分： 1.奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體

2、系的建立 采用組織塊培養(yǎng)法、聯(lián)合應(yīng)用差酶消化法和反復(fù)貼壁法建立體外奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用透射電鏡、免疫組化、免疫印跡等試驗(yàn)技術(shù)方法對(duì)乳腺上皮細(xì)胞特性進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)用本方法建立的奶牛乳腺細(xì)胞系上皮特性及分泌功能特征完備。 2.七味中草藥粗提液對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞促增殖作用的比較研究 研究比較七味中草藥對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外生長(zhǎng)的促增殖效應(yīng)。確定黃芪、王不留行、當(dāng)歸、川芎、栝樓、漏蘆和續(xù)斷粗提物為備

3、篩藥物，采用2-3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMEC)為試驗(yàn)材料，在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的上述中草藥提取液，采用MTT比色法，比較其對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，濃度分別為10 mg/mL的王不留行，20 mg/mL的黃芪，10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黃芪混合物均可極顯著地促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)(p<0.01)，尤以10 mg/mL +20mg/mL的王不留行黃芪配伍組作用效果最好。 3.王不留行

4、與黃芪促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)理的初步研究 試驗(yàn)以2-3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMEC)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，采用流式?xì)胞儀、免疫組織化學(xué)染色法，檢測(cè)王不留行(10 mg/mL)、黃芪(20 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖周期分布、ClycinD1、p27蛋白在乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，濃度分別為10 mg/mL的王不留行，20 mg/mL的黃芪，

5、10 mg/mL+20 mg/mL的王不留行黃芪配伍均可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換(p<0.01)，增加細(xì)胞周期中S期細(xì)胞的數(shù)目(p<0.01)，CyclinD1的陽(yáng)性表達(dá)均得到上調(diào)(p<0.01)，p27的陽(yáng)性表達(dá)均下降(p<0.01)，尤以王不留行黃芪配伍作用明顯。結(jié)果提示，黃芪、王不留行促進(jìn)乳腺細(xì)胞的增殖，是通過(guò)上調(diào)CyclinD1表達(dá)、下調(diào)p27表達(dá)水平，進(jìn)而加速細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換完成的. 4.王不留行

6、與黃芪對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外分泌性能的影響 本試驗(yàn)研究了中草藥黃芪、王不留行對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外分泌性能的影響。以2-3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMEC)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究中草藥黃芪、王不留行作用前后細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的變化、細(xì)胞裂解液中氨基酸總濃度及組分的變化規(guī)律，以及細(xì)胞裂解液中蛋白總濃度的變化，試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，王不留行(10 mg/mL)、黃芪(20 mg/mL)、王不留行與黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg

7、/mL)作用于細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了重塑，表現(xiàn)出更多功能分泌分化的特征標(biāo)志；細(xì)胞裂解液中氨基酸的總濃度均得到提高(p<0.01)，細(xì)胞裂解液中游離氨基酸的總濃度均顯著或極顯著地提高(王不留行(10 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL +20mg/mL)，p<0.01；黃芪(20 mg/mL)，P<0.05；)；細(xì)胞裂解液中蛋白總合量亦有明顯的增高，(王不留行(10 mg/mL)、王不留行黃芪配伍(10 mg/mL

8、+20 mg/mL)，p<0.01；黃芪(20 mg/mL)，P>0.05；)。結(jié)果提示，中草藥黃芪、王不留行可通過(guò)對(duì)乳腺細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)的重塑、促進(jìn)乳腺細(xì)胞吸收胞外游離氨基酸，使乳腺細(xì)胞蛋白合成增多。 5.王不留行與黃芪對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞合成乳鐵蛋白和酪蛋白的影響 本試驗(yàn)以2-3代奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMEC)為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)研究了中草藥王不留行、黃芪對(duì)乳腺細(xì)胞as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白

9、基因表達(dá)的影響；應(yīng)用ELISA競(jìng)爭(zhēng)抑制性法檢測(cè)，王不留行、黃芪作用前后乳腺細(xì)胞裂解液中as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白含量的變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)、王不留行(10 mg/mL)均極顯著提高as1-酪蛋白mRNA的表達(dá)(p<0.01)，黃芪(20 mg/mL)組細(xì)胞as1-酪蛋白mRNA表達(dá)稍低于空白對(duì)照組，差異不顯著(P>0.05)；王不留行黃芪配伍(10 mg/

10、mL +20mg/mL)、王不留行(10 mg/mL)均顯著提高B-酪蛋白mRNA的表達(dá)(p<0.05)，黃芪(20 mg/mL)組細(xì)胞B-酪蛋白mRNA表達(dá)稍高于空白對(duì)照組，差異不顯著(P>0.05)；王不留行黃芪配伍(10 mg/mL+20 mg/mL)顯著提高乳鐵蛋白mRNA的表達(dá)(p<0.05)，王不留行(10 mg/mL)組和黃芪(20 mg/mL)組細(xì)胞乳鐵蛋白mRNA的表達(dá)稍高于空白對(duì)照組，差異不顯著(P>0.05).as

11、1-酪蛋白合成量的檢測(cè)結(jié)果表明，黃芪(20mg/mL)+王不留行(10 mg/mL)配伍作用效果較明顯，其組內(nèi)乳腺細(xì)胞as1-酪蛋白合成量顯著高于空白對(duì)照(P<0.05)；而黃芪(20 mg/mL)組和王不留行(10 mg/mL)組相比較于空白對(duì)照組，組內(nèi)乳腺細(xì)胞as1-酪蛋白合成量略有增高，差異不顯著(P>0.05)。B-酪蛋白合成量的檢測(cè)結(jié)果表明，黃芪(20 mg/mL)+王不留行(10 mg/mL)配伍組和王不留行(10 mg/m

12、L)組細(xì)胞B-酪蛋白合成量顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，黃芪(20 mg/mL)組細(xì)胞B-酪蛋白合成量略高于空白對(duì)照組，但差異不顯著(P>0.05)。乳鐵蛋白合成量的檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，中草藥作用細(xì)胞后，乳腺細(xì)胞乳鐵蛋白合成量均略有增高，但差異不顯著(P>0.05)。 以上五個(gè)試驗(yàn)部分的研究結(jié)果表明：中草藥黃芪、王不留行促進(jìn)乳腺細(xì)胞as1-酪蛋白、B-酪蛋白和乳鐵蛋白的合成，其潛在機(jī)制與其能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增