牛MSCs生物學(xué)特性及體外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的研究.pdf

1、[目的]建立牛骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(marrowmesenchymalstemcells，MSCs)分離培養(yǎng)體系，研究牛MSCs的生物學(xué)特性，并根據(jù)其生物學(xué)特性及體外誘導(dǎo)分化潛能對(duì)其進(jìn)行鑒定;探討牛MSCs體外定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行特異性標(biāo)志基因的分子生物學(xué)檢測(cè)，為轉(zhuǎn)基因良種肉牛培育提供種子細(xì)胞，提高轉(zhuǎn)基因的效率。
　　 [方法]
　　 1、通過(guò)貼壁篩選法分離培養(yǎng)牛MSCs，觀察其生長(zhǎng)特性。

2、　　 2、利用染色、核型分析以及繪制生長(zhǎng)曲線和計(jì)算貼壁率的方法對(duì)純化后，可以穩(wěn)定傳代的牛MSCs生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定;在體外成功的定向誘導(dǎo)牛MSCs分化為脂肪樣細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞，并對(duì)誘導(dǎo)出現(xiàn)的脂肪樣細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞分別用油紅O染色鑒定和VonKossa染色鑒定。
　　 3、利用獲取純化穩(wěn)定的P4、P8、P12代牛MSCs經(jīng)5umol/L、10umol/L、15umol/L三種濃度的5-氮雜胞苷(5-Aza)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，經(jīng)

3、3周誘導(dǎo)后，隨機(jī)取10個(gè)非重疊視野(×200)，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。并對(duì)誘導(dǎo)出現(xiàn)的心肌樣細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定。
　　 [結(jié)果]獲得了高純度且增殖能力較強(qiáng)的牛MSCs，并在體外成功誘導(dǎo)其分化為脂肪樣細(xì)胞和成骨樣細(xì)胞，并且染色體核型分析正常，利用5-Aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞大多呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，排列方向一致，有肌管樣結(jié)構(gòu)形成。相同代數(shù)的牛MSCs在10umol/L的5-Aza作用下誘導(dǎo)效果最佳;在相

4、同濃度的5-Aza作用下，牛MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率隨著傳代次數(shù)的增加逐漸降低。P4代牛MSCs在10umol/L的5-Aza經(jīng)3周的作用下，誘導(dǎo)分化率最高，達(dá)到48.6％.。RT-PCR結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞明顯表達(dá)心肌細(xì)胞的四種特異性標(biāo)志基因，分別是α-心臟肌動(dòng)蛋白(378bp)，結(jié)蛋白(601bp)，心臟肌鈣蛋白T(331bp)，β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）(273bp)。
　　 [結(jié)論]
　　 1、本試驗(yàn)從

5、牛骨髓中分離培養(yǎng)的這種成纖維貼壁細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下能夠在體外分化為脂肪樣和成骨樣細(xì)胞，表明其具有多項(xiàng)分化潛能，根據(jù)細(xì)胞可以穩(wěn)定傳代保持未分化狀態(tài)及染色后的形態(tài)學(xué)特征和染色體核型分析，證明這種細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞基本生物學(xué)特征。
　　 2、牛MSCs體外經(jīng)5-氮雜胞苷3周定向誘導(dǎo)能分化為心肌細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，表達(dá)出了心肌細(xì)胞四種特異性標(biāo)志基因，分別是α-心臟肌動(dòng)蛋白(378bp)，結(jié)蛋白(601b