奶牛乳腺干細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定研究.pdf

1、目的:
　　 體外分離培養(yǎng)奶牛MaSCs，研究其生物學特性，并對其進行體外擴增和鑒定，開辟奶牛乳腺疾病治療的新途徑，為乳腺生物反應器的制備提供種子細胞。
　　 方法:
　　 本試驗分為三個部分:試驗一分離MaSCs，并進行原代和傳代培養(yǎng)純化，繪制其生長曲線和瑞氏-吉姆薩(RS-GMS)染色來研究其生物學習性，并對細胞進行凍存和復蘇。試驗二取6月齡和18月齡奶牛乳腺組織分離培養(yǎng)MaSCs，比較其生長特點及增殖能力。

2、試驗三對分離培養(yǎng)并傳代純化的MaSCs通過堿性磷酸酶（AKP）染色、染色體核型分析和αs1-酪蛋白基因和k-酪蛋白基因的PCR擴增來進行鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 1.本試驗應用貼壁篩選法成功分離得到奶牛MaSCs，體外培養(yǎng)到第12代，細胞數(shù)量擴增到5000倍以上。本試驗分離得到的奶牛MaSCs具有干細胞的典型特征:外形呈多角形、長梭形或橢圓形，細胞核質(zhì)比較大、胞漿中細胞器少、核仁明顯。奶牛MaSCs具有快速增殖能力，細

3、胞形態(tài)均一，排列有序，體外培養(yǎng)12代細胞活性仍無變化。
　　 2.6月齡組牛MaSCs增殖能力、貼壁能力、培養(yǎng)形成的細胞集落數(shù)均高于18月齡組。
　　 3.瑞氏-吉姆薩(RS-GMS)染色證明奶牛MaSCs各代之間形態(tài)較一致，絕大多數(shù)細胞為典型的成纖維樣，細胞呈漩渦狀排列，細胞形態(tài)以梭形為主，有少量小圓形細胞和大而扁的細胞。
　　 4.堿性磷酸酶(AKP)染色細胞呈陽性，證明所得細胞為比較原始的細胞。
　　

4、 5.奶牛MaSCs核型分析表明該細胞具有正常核型，該細胞狀態(tài)穩(wěn)定，體外培養(yǎng)條件下沒有發(fā)生惡化。
　　 6.奶牛MaSCsαs1-酪蛋白擴增的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條長1736bp的片段，k-酪蛋白基因酪蛋白基因擴增出一條長度為780bp的目的條帶，擴增片段特異性良好，無雜帶出現(xiàn)，目的片段的大小與預期結(jié)果相吻合。
　　 綜上所述，本試驗分離得到的奶牛MaSCs的確為比較原始的細胞，根據(jù)形態(tài)特征、增殖能力、及鑒