金黃色葡萄球菌毒力分型及其毒素致乳腺上皮細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)對山東及周邊牛場做了乳房炎的檢測，采集并分離了129株金黃色葡萄球菌，并對金黃色葡萄球菌毒力因子設(shè)計相關(guān)引物，通過分子PCR的方法，對耐熱核酸酶、凝固酶、耐消毒劑基因、殺白細(xì)胞素基因、耐甲氧西林基因、α-溶血素及β-溶血素基因做一個分布調(diào)查，對它們的做一個基因分型。以重組α-溶血素對小鼠乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行攻擊，對細(xì)胞因子IL2、IL6、TNF-α進(jìn)行檢測，探討重組α-溶血素對小鼠乳腺細(xì)胞的損傷及凋亡的影響。希望對本實(shí)驗(yàn)室所分離金葡菌

2、做一系統(tǒng)的鑒定和分型，構(gòu)建金葡菌種質(zhì)資源庫，得到金葡菌分子流行病學(xué)資料，為奶牛金葡菌引起的乳腺炎的防治提供新思路。
　　1、牛源性金葡菌各種毒力因子基因型的檢測
　　設(shè)計耐熱核酸酶、凝固酶、耐消毒劑基因、殺白細(xì)胞素基因、耐甲氧西林基因、α-溶血素及β-溶血素引物，進(jìn)行PCR檢測。表型分型56株表現(xiàn)為α溶血，檢出率為43.4％；43株表現(xiàn)為β溶血，檢出率為34.11％；另有29株表現(xiàn)為不溶血，檢出率為22.48％；其中hla基

3、因檢出率34.88％，hlb基因檢出率為42.60％。發(fā)現(xiàn)46株 Pvl基因陽性株，檢出率為35.66％；其中coa生化檢測(試管法)，可使兔血清凝固的有50株，生化方法檢出率為38。76％，coa基因檢測陽性株有39株，基因檢出率為30.23％，其中生化與基因檢測能對應(yīng)的有14株，對應(yīng)符合率為10.85％；在對nuc(耐熱核酸酶)的檢測中，甲苯胺藍(lán)生化檢測有106株陽性，生化檢出率為82.17％，基因檢測有31株陽性，基因的檢出率為2

4、4.03％，其中生化與基因檢測能對應(yīng)的有28株，對應(yīng)率為21.71％；在對mec-a基因的檢測中，共發(fā)現(xiàn)有25株陽性株，基因的檢出率為19.38％；在對qac-a基因的檢測中，發(fā)現(xiàn)有13株陽性菌株，基因的檢出率為10.08％。
　　在溶血表型中，α溶血要多于β溶血；hlb基因的檢出率比 hla基因的檢出率要高。金黃色葡萄球菌所檢出溶血素基因與血瓊脂平板出現(xiàn)的溶血現(xiàn)象并非一一對應(yīng)關(guān)系。發(fā)現(xiàn)46株 Pvl基因陽性株，檢出率為35.66

5、％，較人醫(yī)上的檢測率沒有較大的差異，說明大多數(shù)金葡菌都是含有殺白細(xì)胞素。其中50株可使兔血清凝固，檢出率為38。76％，凝固酶基因檢測陽性株有39株，基因檢出率為30.23％，證明凝固酶基因是普遍存在的，與各種文獻(xiàn)報道一致。對金葡菌致病性菌株的重要指標(biāo)之一 nuc(耐熱核酸酶)的基因檢測中有31株陽性，基因的檢出率為24.03％，說明此基因檢測可以作為對致病性金葡菌檢測的一個方法補(bǔ)充。Mec-a的檢出，說明在我們山東周邊牛場已經(jīng)出現(xiàn)了M

6、RSA菌株，存在著抗生素濫用及亂用的現(xiàn)象。其中耐消毒劑基因 qac-a的檢測中，在總樣本中金葡菌中共檢測出了13株。這說明在山東省的某些牛場里存在著消毒劑的不規(guī)范使用，在劑量和各種消毒劑的優(yōu)化配置上還存在著問題。
　　以分子生物學(xué) PCR的方法對上述毒力因子設(shè)計引物，進(jìn)行擴(kuò)增，檢測結(jié)果還是顯著的。也應(yīng)注意到 PCR的檢測結(jié)果和生化的檢測結(jié)果并不是完全一樣的，對于基因檢出率高的毒力因子，有可能是該基因沉默了，導(dǎo)致相應(yīng)蛋白不表達(dá)；而對

7、于生化檢出率高于基因檢出率的情況，則要考慮提高基因檢測的準(zhǔn)確率，增加檢測次數(shù)以降低差異。
　　2、重組α溶血素對小鼠乳腺細(xì)胞的損傷及凋亡研究
　　本實(shí)驗(yàn)用已構(gòu)建好的基因工程菌表達(dá)并純化金葡菌主要毒力蛋白α-溶血素，用其攻擊培養(yǎng)的小鼠乳腺細(xì)胞，以期比較得出各型金葡菌及各毒力因子的致病性差異，尋求金葡菌保護(hù)性抗原。對純化的α溶血素進(jìn)行蛋白含量測定，顯示為940μg/ml。本實(shí)驗(yàn)用重組α-溶血素對小鼠乳腺細(xì)胞攻毒，檢測細(xì)胞因子 I

8、L2、IL6、TNF-α。對照組和實(shí)驗(yàn)組之間的TNF-α含量呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，3組達(dá)到最高，5組有升高的趨勢。對照組和實(shí)驗(yàn)組之間的IL-2和IL-6含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，且在3組達(dá)到峰值。3組乳腺細(xì)胞中TNF-α、IL-2和IL-6較對照組存在統(tǒng)計學(xué)意義且變化趨勢一致。與對照組對比以后，發(fā)現(xiàn)重組α-溶血素對小鼠乳腺細(xì)胞可引起一定的細(xì)胞損傷。
　　通過本實(shí)驗(yàn)的開展，希望可以建立金葡菌系統(tǒng)鑒定和分型的技術(shù)平臺，獲得金葡菌的