粘附素ClfA和Cna對金黃色葡萄球菌乳腺炎的免疫保護研究.pdf

1、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是引起奶牛乳腺炎的眾多病原中的最重要的一種病原菌，而且引起的乳腺炎存在治療成本高、“抗性奶”和耐藥菌株等問題而嚴(yán)重影響奶牛業(yè)和乳品業(yè)的發(fā)展。金黃色葡萄球菌表面的粘附素ClfA和Cna能夠介導(dǎo)S.aureus粘附到宿主細胞，故在S.aureus的感染中發(fā)揮著重要作用。國內(nèi)外越來越多的研究者也將粘附素作為靶抗原來開發(fā)研制新型的乳腺炎疫苗。本研究擬在以小鼠乳腺炎為模

2、型綜合評價粘附素ClfA和Cna的免疫原性、對小鼠免疫的效果及對小鼠金黃色葡萄球菌乳腺炎的保護力，為研制金黃色葡萄球菌乳腺炎亞單位疫苗奠定一定的基礎(chǔ)。
　　 運用PCR方法擴增出臨床分離的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌J9株ClfA基因，大小為1017bp。將其與PMD18-T載體連接，構(gòu)建克隆載體?？寺≥d體酶切鑒定正確后采用亞克隆技術(shù)構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-ClfA，酶切鑒定及測序結(jié)果都表明獲得了正確的原核表達質(zhì)粒p

3、ET-28a(+)-ClfA。此外，本實驗室也獲得了Cna基因的原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-Cna。將兩種重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得大小分別為46kD和55kD左右的目的蛋白；蛋白經(jīng)鎳離子親和樹脂純化后，得到了高純度的目的蛋白。用兔抗S.aureus免疫血清和鼠抗重組蛋白免疫血清，以Westernblot方法分析ClfA蛋白和Cna蛋白免疫原性顯示重組蛋白具有很好的免疫原性。
　　 將純化的蛋

4、白及滅活的金黃色葡萄球菌J9株與白油佐劑、弗氏佐劑和SeppicISA206佐劑乳化制成亞單位疫苗和滅活疫苗，經(jīng)腹腔免疫小鼠。免疫程序結(jié)束后，選取三種佐劑中血清抗體效價最高的白油佐劑免疫組進行乳腺內(nèi)金黃色葡萄球菌灌注攻毒試驗、免疫血清識別菌體試驗、免疫血清調(diào)理中性粒細胞吞噬試驗、細胞因子IL-4和IL-6含量測定及病理組織切片檢測等攻毒保護力實驗和免疫效果評價實驗。結(jié)果顯示，(1)亞單位疫苗均誘導(dǎo)出了高于滅活苗的IgG水平，且誘導(dǎo)出的I

5、gG是以IgG1為主；(2)與PBS對照組相比，亞單位疫苗免疫組血清與金黃色葡萄球菌表面抗原結(jié)合能力更強；(3)經(jīng)ClfA亞單位疫苗免疫血清調(diào)理的細菌較滅活疫苗組和PBS對照組被中性粒細胞吞噬的數(shù)量更多(P＜0.05)；(4)攻毒后，亞單位疫苗免疫組乳腺內(nèi)細菌數(shù)較對照組顯著降低(P＜0.05)且低于滅活疫苗組；(5)亞單位疫苗疫苗能夠較好地保持小鼠乳腺結(jié)構(gòu)完整性及較少的多形核粒細胞浸潤。
　　 以上研究結(jié)果表明ClfA蛋白及Cn