應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)和microRNA測(cè)序篩選奶牛金黃色葡萄球菌人工誘導(dǎo)乳腺炎關(guān)鍵基因的研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖業(yè)中流行最廣，造成經(jīng)濟(jì)損失最大的一種奶牛疾病，國(guó)內(nèi)外對(duì)奶牛乳腺炎的研究已經(jīng)有百余年歷史，但是至今仍未徹底解決這一難題。金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的主要致病菌之一，通過研究奶牛乳腺感染金黃色葡萄球菌后引起乳腺炎發(fā)生過程中miRNAs和基因的特異性表達(dá)，可以有目的地調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生中某些蛋白的表達(dá)，有利于發(fā)展出一套新的奶牛乳腺炎預(yù)防、治療方法。本研究利用金黃色葡萄球菌人工感染中國(guó)荷斯坦奶牛乳腺，構(gòu)建金黃色葡萄球菌人工感染

2、奶牛乳腺炎疾病模型;再分別采集金黃色葡萄球菌誘發(fā)乳腺炎和正常健康乳腺組織提取總RNA，分離、構(gòu)建文庫(kù)。利用Affymetrix?；蚪M表達(dá)譜芯片技術(shù)分析金黃色葡萄球菌人工感染奶牛乳腺組織引起乳腺炎后全基因組范圍內(nèi)的基因差異表達(dá)，并利用Q-PCR技術(shù)對(duì)基因芯片的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和Pathway分析。同時(shí)利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)分析健康乳腺和乳腺炎乳腺的miRNA表達(dá)差異;利用Q-PCR技術(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果及其靶基因進(jìn)行

3、驗(yàn)證。采用生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)這些miRNA可能的靶基因，并對(duì)靶基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)本研究成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌人工感染奶牛乳腺炎疾病模型，感染后的奶牛表現(xiàn)明顯的臨床型乳腺炎癥狀。
　　(2)基因表達(dá)譜芯片共篩選出顯著差異基因297個(gè)，188個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，109個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(FC＞2，P＜0.05)。再采用Q-PCR隨機(jī)選擇8個(gè)顯著差異表達(dá)的基因（C3、TLR8、B

4、oLA-DRB3、PTX、CSF3、SLC11A1、CD80、IL17A，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)定量分析，獲得與基因芯片分析一致的結(jié)果。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析，共注釋到151個(gè)GOTerms（GO注釋）(P＜0.05)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯著富集到15條Pathway，主要有:自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用信號(hào)通路、造血細(xì)胞譜系信號(hào)通路、細(xì)胞因子信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等。
　　(3)利用Solexa高通量測(cè)序技術(shù)分別

5、對(duì)金黃色葡萄球菌感染組乳腺組織（金葡組）和健康組乳腺組織（健康組）進(jìn)行測(cè)序分析，金葡組和健康組分別獲得21，293，853條和19，142，094條原始序列，過濾低質(zhì)量、重復(fù)等序列后獲得20，847，000條、9，535，613條純凈序列。通過和相應(yīng)mirbase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，金葡組鑒定有358個(gè)已知miRNA和232個(gè)候選miRNA，健康組鑒定有373個(gè)已知miRNA和399個(gè)候選miRNA。比對(duì)分析表明，金葡組和健康組相比，共有7

6、7條miRNA表達(dá)差異顯著(P＜0.01，log2＞1)。選擇其中10個(gè)差異顯著表達(dá)的miRNA(bta-miR-223、bta-miR-31、bta-miR-205、bta-miR-145、bta-miR-132、bta-miR-130b、bta-miR-200b、bta-miR-1246、bta-miR-196a、bta-miR-184)進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果和測(cè)序結(jié)果一致。對(duì)這些差異miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到1979

7、2個(gè)靶基因。GO分析表明這些靶基因參與調(diào)控細(xì)胞的結(jié)合、催化活性、免疫等過程，KEGG分析顯示其主要富集于環(huán)境微生物代謝信號(hào)通路、內(nèi)吞作用信號(hào)通路、嗅覺轉(zhuǎn)換信號(hào)通路、癌癥信號(hào)通路等。
　　(4)將miRNA測(cè)序和mRNA表達(dá)譜結(jié)果進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示共得到233對(duì)負(fù)關(guān)聯(lián)的miRNA/mRNA，其中miRNA下調(diào)，mRNA上調(diào)的為162對(duì);miRNA上調(diào)，mRNA下調(diào)的為71對(duì)。上述選擇的10個(gè)差異顯著的miRNA關(guān)聯(lián)到47個(gè)靶基因

8、，通過Q-PCR技術(shù)對(duì)其中8個(gè)差異顯著基因（ST3GAL3、IL13RA2、ARID3A、ADAP1、SYNE2、SLCO4A1、GRAMD1C、SLC5A1）進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，結(jié)果顯示:ST3GAL3、IL13RA2、ARID3A、ADAP1、SLCO4A1基因在金葡組表達(dá)顯著高于健康組，而SYNE2、GRAMD1C、SLC5A1基因在金葡組表達(dá)均低于健康組，基因表達(dá)情況與芯片的結(jié)果一致，上述結(jié)果表明這些差異基因可能是金黃色葡萄球菌誘