MASP-2變異研究及其與奶牛乳腺炎關系分析.pdf

1、甘露糖結合凝集素相關的絲氨酸蛋白酶-2(mannan binding lectin-associated serine protease2,MASP-2)是補體凝集素溶血途徑中的重要一員,在啟動補體凝集素溶血途徑中發(fā)揮著至關重要的作用. MASP-2主要在肝臟中表達,與MBL(Mannan-Binding Lectins)或纖維凝膠蛋白(ficolin)分子結合形成大分子復合物,有著重要的生物學功能.本論文著重研究了以下三個方面:

2、>　　1.MASP-2基因多態(tài)性與奶牛生產性狀關聯性分析
　　本課題以759頭中國荷斯坦奶牛為研究對象,檢測了MASP-2基因的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點,對MASP-2基因多態(tài)性與荷斯坦奶牛產奶性狀(305天產奶量、乳脂率、乳蛋白率)、SCS(Somatic Cell Score,體細胞評分)進行關聯性分析,篩選與奶牛產奶性狀相關的SNP,意在為未來培育出綠色健康,高產奶量、高乳脂率和高乳蛋白率的荷斯坦奶牛提供可用的分子標記

3、和理論依據.
　　經DNA測序和相關目的序列比對發(fā)現,MASP-2基因中g.-282 G>A,g.478 G>A,g.506 G>A,g.511 T>C和g.13808 G>A存在5個新的SNP位點. g.-282 G>A處于5'側翼區(qū); g.478 G>A,g.506 G>A,g.511 T>C處于第3外顯子區(qū),其中g.506 G>A突變導致MASP-2蛋白第102位的的甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸,g.478 G>A位點突變后第92位絲

4、氨酸不變,g.511 T>C位點突變后第103位天冬酰胺不變,兩個都為同義突變;g.13808 G>A處于第11外顯子,它的突變能夠導致MASP-2蛋白第529位天冬氨酸突變?yōu)樘於０?應用PCR-RFLP等試驗方法對MASP-2基因進行分型后發(fā)現,g.-282 G>A,g.478 G>A,g.511 T>C三個SNP位點完全連鎖.數據分析后發(fā)現MASP-2試驗牛群中SNPs組成的單倍型有13種,有7種單倍型組合的數量滿足統(tǒng)計分析要求,

5、其中H1H2單倍型的產奶量最高,H1H4單倍型的乳脂率最高,H1H8單倍型組合的乳蛋白率最高而且SCS最低,為乳腺炎抗性單倍型組合.2.MASP-2基因可變剪接體的鑒定
　　根據典型奶牛乳腺炎癥狀和體細胞評分數據,分別采集3頭健康組(Healthy)和3頭患乳腺炎組(Mastitis)中國荷斯坦牛各組織樣品.經RT-PCR和克隆測序后發(fā)現MASP-2基因存在四種可變剪接體,分別命名為MASP-2 A125,MASP-2 A145,

6、MASP-2 A25，MASP-2 A245,全轉錄本命名為MASP-2 complete.四種可變剪接體形式分別為內含子保留和外顯子缺失.在隨機挑取的35個單克隆中,四種可變剪接體出現的總頻率為22.9％.五種轉錄本均主要在肝臟中表達,分析發(fā)現在乳腺炎牛中MASP-2 complete是主轉錄本,在健康牛中MASP-2 complete、MASP-2 A25相對于其它的轉錄本表達量較高.MASP-2 A125,MASP-2 A245轉

7、錄本在乳腺炎牛和健康牛中的表達量存在顯著性差異(P＜0.05),而MASP-2 A25差異極顯著(P＜0.01).
　　3.MASP-2基因啟動子活性分析
　　以?；蚪M序列為基礎,克隆了中國荷斯坦奶牛MASP-2基因的上游調控序列,并利用在線預測軟件對其進行了生物信息學分析,構建出了具有不同長度的缺失片段表達載體,利用雙熒光素酶報告活性系統(tǒng),瞬時轉染人肝癌細胞(HepG2細胞)和人胚腎上皮細胞(293T細胞)后,分析了MA

8、SP-2上游調控序列不同長度片段的啟動子活性。
　　研究發(fā)現牛MASP-2基因啟動子的表達不具有嚴格的細胞特異性,在兩種細胞中都有啟動子活性。進一步研究發(fā)現該段上游調控序列雖然在293T細胞中也有啟動子活性存在,但是活性明顯弱于HepG2細胞中的啟動子活性,在肝癌細胞中+245—+577 bp處有基礎啟動子活性。結果顯示在基因的-1915—1136 bp和-666—-244 bp處存在負調控元件,在-1136—-666 bp和-2