豬繁殖與呼吸綜合征病毒分子流行病學調(diào)查及豬細環(huán)病毒感染對其疫苗免疫的影響.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（藍耳?。?porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的豬的一種高度接觸性傳染病，該病以母豬流產(chǎn)、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率等為主要特征。2006年春夏之交，我國中東部地區(qū)爆發(fā)豬的“無名高熱病”，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)國家相關部門調(diào)查研究證實，其主要病原之一是豬繁殖與呼吸綜合征病

2、毒變異株。豬細環(huán)病毒(Torque teno sus vires，TTSuVs)是新發(fā)現(xiàn)病毒，目前豬體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)了TTSuV1和TTSuV2兩種病毒，廣泛存在于家豬、野豬。我國各地豬病多發(fā)，混合感染嚴重，豬細環(huán)病毒也是可能的病原。本研究開展了PRRSV的分子流行病學調(diào)查，并研究了TTSuV1自然感染對PRRSV疫苗免疫的影響。
　　 1、華東地區(qū)PRRSV分子流行病學調(diào)查
　　 為了解華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRR

3、SV)分子流行病學特征，運用RT-PCR方法對來自江蘇、浙江、安徽、山東、上海、福建等6省市2006-2010年間的1509份臨床發(fā)病豬和927份臨床健康豬病料進行了PRRSV檢測，并從每個省市PRRSV陽性樣品中任選6株變異株和3株經(jīng)典株進行了NSP2和ORF5的基因測序。結果發(fā)現(xiàn)：臨床發(fā)病豬中變異株陽性樣品984份(65.2％)，經(jīng)典株陽性樣品233份(15.4%)；臨床健康豬中變異株陽性樣品53份(5.7%)，經(jīng)典株陽性樣品65份

4、(7．O%)。NSP2基因測序結果表明在中國部分地區(qū)存在2種不同NSP2基因型毒株（經(jīng)典株和變異株）的廣泛流行，但PRRSV變異株的氨基酸缺失位置和數(shù)目并不完全一致，氨基酸同源性為44.0%-100%。ORF5測序結果顯示在各個PRRSV分離株內(nèi)存在著大量氨基酸的點突變，氨基酸同源性為86.6%-100%。上述結果表明：我國豬群中PRRSV變異株和經(jīng)典株同時廣泛流行，但變異株占優(yōu)勢；臨床健康豬群中也存在較多的PRRSV隱性感染；ORF5

5、、NSP2基因變異現(xiàn)象普遍存在，不同地區(qū)PRRSV分離株的遺傳關系存在交叉現(xiàn)象，地域特征不明顯。
　　 2、 PRRSV變異株和經(jīng)典株感染仔豬的差異性分析
　　 將豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株(VS-PRRSV)和經(jīng)典株(CS-PRRSV)感染仔豬，對其致病性和血液學、免疫學的指標進行了比較。選擇15頭3周齡健康商品仔豬，隨機平均分為3組。每組豬分別于頸部肌肉接種VS-PRRSV、CS-PRRSV和生理鹽水，接種后隔離飼

6、養(yǎng)觀察7周。觀察臨床癥狀、病理組織學變化，檢測抗體水平及免疫相關的指標．試驗結果發(fā)現(xiàn)VS-PRRSV感染組獵體溫急劇升高到41℃以上，臨床癥狀更加嚴重，發(fā)病率100%，死亡率80%；肺臟間質(zhì)性肺炎嚴重，肺泡膈增厚，巨噬細胞大量浸潤；CD4和CD8 T淋巴細胞數(shù)下降更加迅速，恢復更為緩慢，CD4/CD8比值在10～21 dpi時顯著低于陰性對照組和CS-PRRSV感染組；VS-PRRSV感染組豬出現(xiàn)持續(xù)35天的病毒血癥，而CS-PRRSV

7、感染組只有28天；抗-PRRSVN蛋白抗體產(chǎn)生提前了3天，而中和抗體產(chǎn)生推遲了7天；Th1和Th2之間動態(tài)平衡“漂移”次數(shù)增加1次；MHC-1、MHC-2及C3的mRNA水平在較長一段時間內(nèi)被抑制；而CS-PRRSV感染組豬僅出現(xiàn)輕微臨床癥狀和病理變化，免疫學指標變化相對比較緩和。結果表明：接種VS-PRRSV后產(chǎn)生更加嚴重的致病性，細胞免疫及體液免疫均被進一步抑制。
　　 3、華東豬群中PRRSV與TTSuVs混合感染的檢測<

8、br>　　 從江蘇、安徽、浙江、山東、上海、江西6省市2006-2010年間不同豬群中收集臨床有疑似PRRSV感染發(fā)病病死豬的組織樣品1457份，以及臨床健康豬的組織樣品927份。用PCR方法檢測各個樣品中PRRSV和TTSuV1、TTSuV2。結果表明：1457份臨床發(fā)病豬樣品中，三種病毒的檢出率分別為71.7%(PRRSV)、58.4%(TTSuV1)和48.0%(TTSuV2)，單重感染和陰性個體僅占23.5%和4.9%，且存在

9、非常嚴重的雙重感染(67.6%)和三重感染(11.4%)。927份臨床健康豬的組織樣品中，三種病毒的檢出率分別為7.7%(PRRSV)、49.4%(TTSuV1)和55.7%(TTSuV2)，單重感染和陰性個體為37.3%和10.8%，雙重感染和三重感染僅占7.1%和2.4%。PRRSV陽性樣品中TTSuV1(65.3%)和TSuV2(49.8%)的感染率均較高，TTSuVs總感染率高達94.3%; PRRSV陰性樣品中TTSuVl(4

10、7.2%)和ITSuV2(54.1%)的感染率也較高，TTSuVs總感染率仍高達86.4%。結果表明PRRSV、TTSuV1和TTSuV2在華東地區(qū)豬群中廣泛分布，臨床發(fā)病豬的PRRSV和TTSuVs的檢出率明顯高于臨床健康豬，TTSuV1和（或）TTSuV2極有可能對PRRSV等病毒感染有協(xié)同作用。
　　 4、 TTSuVI自然感染對PRRS活疫苗免疫效果的抑制作用
　　 為研究豬細環(huán)病毒1型( TTSuV1)自然感染

11、對藍耳病活疫苗刺激機體產(chǎn)生抗體的影響，本實驗從中國江蘇兩家豬場選擇了4周齡的TTSuV1陽性豬15頭和陰性豬20頭。TTSuV1陽性豬平均分成三組，陰性豬平均分成四組。6周齡用藍耳病活疫苗進行免疫，10周齡用強毒力PRRSV攻毒。同時設立TTSuV1陰性對照組和非免疫對照組。試驗過程中，檢測了PRRS MLV免疫后仔豬的免疫反應、細胞因子變化和保護性實驗。結果顯示：疫苗免疫實驗中，TTSuV1陽性免疫組（D組）的PRRS病毒抗體、IFN

12、-γ、IL-10水平和T淋巴細胞增殖能力全程低于TTSuV1陰性免疫組（B組），但僅在28dpi時D組抗體水平（S/P值：2.05）明顯低于B組(S/P值：2.21，P

13、的攻毒試驗中，TTSuV1陽性免疫組（F組）出現(xiàn)比TTSuV1陰性免疫組（E組）更加嚴重的臨床癥狀，肺臟病變更加明顯(p<0.005），F(xiàn)組抗體水平在攻毒后7～14天顯著低于E組(P　　 5、TTSuV1自然感染

14、在PRRSV陽性豬體內(nèi)的病毒分布
　　 為深入研究探討豬自然感染豬細環(huán)病毒1型( Torque teno sus virus，TTSuV1)后病毒在豬繁殖與呼吸綜合征病毒( PRRSV)陽性豬體內(nèi)的分布情況，分析病毒對豬器官組織的嗜性，揭示豬細環(huán)病毒的致病機制。利用建立的TTSuV1 SYBR Green1實時定量PCR檢測方法，定量檢測自然感染豬和同時混合感染有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的仔豬器官組織中TTSuV1 DNA的相對含

15、量，分析豬細環(huán)病毒的組織嗜性及其與豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染時的相互作用機制。結果在多種器官組織中均可檢測到TTSuV1，在感染仔豬的脾臟、肺臟、胰臟、氣管、腸系膜淋巴結(MLN)和腹股溝淋巴結( ILN)中TTSuV1 DNA含量較高，為3.5×107拷貝/g-2.3×los拷貝/g;肝臟、肛拭子和鼻拭子中含量較低，為1.9×107拷貝/g-2.7×107拷貝/g;心臟、脂肪和腸中沒有檢測到該病毒。TTSuV1和PRRSV混合感染