我國(guó)鼬獾狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究.pdf

1、鼬獾（Melogale moschata）是一種廣泛分布于我國(guó)華東、華南等地的小型鼬科動(dòng)物，我國(guó)關(guān)于鼬獾狂犬病的首次報(bào)道，可追溯到上世紀(jì)90年代初。此后，在浙江、江西、安徽等地，均有因鼬獾咬傷導(dǎo)致狂犬病發(fā)病死亡的病例發(fā)生，當(dāng)時(shí)的狂犬病診斷均根據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)調(diào)查得出，但未進(jìn)行病原學(xué)確診。鼬獾頻繁引起人感染狂犬病的現(xiàn)象表明，鼬獾可能是除犬外，又一重要的狂犬病貯存宿主和傳播宿主，并嚴(yán)重危害這些地區(qū)的公共衛(wèi)生安全。國(guó)內(nèi)以前關(guān)于野生動(dòng)物狂犬

2、病流行病學(xué)方面的研究缺乏，對(duì)于鼬獾狂犬病的研究更不系統(tǒng)，這些地區(qū)鼬獾種群內(nèi)是否存在狂犬病病毒流行，流行毒株與我國(guó)現(xiàn)有和歷史流行毒株關(guān)系，以及其可能來(lái)源等問(wèn)題，都需要通過(guò)系統(tǒng)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、調(diào)查及深入分析研究得以闡明?？刂埔吧鷦?dòng)物狂犬病最有效的措施是對(duì)其進(jìn)行口服免疫，目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面的研究與報(bào)道。
　　針對(duì)上述問(wèn)題，開(kāi)展以下研究:
　　1.鼬獾狂犬病流行病學(xué)監(jiān)測(cè)與病毒演化分析。研究?jī)?nèi)容:①鼬獾腦組織樣品的采集與檢測(cè)。在江西、

3、浙江等地采集不明原因死亡鼬獾腦組織樣品，并進(jìn)行直接免疫熒光法檢測(cè)。②狂犬病病毒的分離與鑒定。對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的樣品，經(jīng)乳鼠腦內(nèi)接種分離病毒。③鼬獾源狂犬病病毒N基因和G基因的擴(kuò)增及測(cè)序。④狂犬病病毒N基因和G基因序列相似性與遺傳演化分析;分析整理獲得的數(shù)據(jù)，使用遺傳分析軟件，對(duì)鼬獾源狂犬病病毒序列和我國(guó)流行毒株序列進(jìn)行對(duì)比分析，分析鼬獾分離株之間是否存在進(jìn)化差異，從而確定鼬獾狂犬病在這些地區(qū)流行范圍和趨勢(shì)，并分析鼬獾狂犬病與我國(guó)犬和人群中流行

4、狂犬病間的關(guān)系。⑤鼬獾源狂犬病病毒N基因演化分析。通過(guò)對(duì)病毒演化時(shí)間推算，揭示其可能來(lái)源，評(píng)價(jià)其公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)，為制定相應(yīng)狂犬病防控對(duì)策提供理論依據(jù)。
　　2.鼬獾源狂犬病病毒全基因組測(cè)序與分析。研究?jī)?nèi)容:①全基因組序列擴(kuò)增及測(cè)序。根據(jù)N基因（G基因）遺傳進(jìn)化分析結(jié)果，選取不同分枝毒株(JX09-17(fb)、JX09-18、JX10-37)進(jìn)行全基因測(cè)序。②全基因組序列分析。將不同分枝毒株的全基因組核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比，并與

5、其他流行株和疫苗株進(jìn)行比對(duì)，分析各結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸發(fā)生突變的位點(diǎn)。
　　3.重組疫苗和弱毒疫苗對(duì)鼬獾的口服免疫試驗(yàn)。研究?jī)?nèi)容:①鼬獾的口服免疫試驗(yàn)。選取重組疫苗(CAV-2-E3△-RGP)和弱毒疫苗(SRV9)分別口服免疫20只鼬獾。②免疫前及免疫后14天、21天分別對(duì)免疫鼬獾采血，按照熒光抗體病毒中和試驗(yàn)（FAVN）方法，測(cè)定狂犬病病毒中和抗體水平。③統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，分析和評(píng)價(jià)兩種疫苗的免疫效果，并比較是否存在差異。
　　通

6、過(guò)以上試驗(yàn)，獲得以下結(jié)果:
　　1.流行病學(xué)調(diào)查與演化分析結(jié)果顯示，通過(guò)連續(xù)6年監(jiān)測(cè)，共檢測(cè)鼬獾腦組織樣品2932份，陽(yáng)性91份（平均陽(yáng)性率3.1％），經(jīng)MIT分離獲得91株狂犬病病毒。進(jìn)化分析表明，這些毒株形成4個(gè)進(jìn)化分枝(CladeA、Clade B、CladeC、CladeD)，對(duì)應(yīng)的病毒樣品，來(lái)源于不同的地區(qū):CladeA，包括46株病毒，主要分布于浙江千島湖周圍和鄱陽(yáng)湖以東地區(qū)，與我國(guó)狂犬病病毒ChinaⅡ進(jìn)化關(guān)系較近，

7、處于同一進(jìn)化分枝;Clade C，有27株病毒，主要分布于鄱陽(yáng)湖以西地區(qū)，該分枝毒株進(jìn)化關(guān)系相對(duì)獨(dú)立，與我國(guó)狂犬病病毒ChinaⅠ和ChinaⅡ的進(jìn)化關(guān)系均較遠(yuǎn);Clade B，8株病毒，分布在江西省撫州地區(qū)，與我國(guó)狂犬病病毒ChinaⅠ內(nèi)的犬源分離株核苷酸相似性較高，進(jìn)化關(guān)系較近;Clade D，10株病毒，該分枝內(nèi)還包括1株浙江省犬源狂犬病病毒，分布于浙江省臺(tái)州地區(qū)，與Clade B鼬獾分離株進(jìn)化關(guān)系較近，同屬我國(guó)狂犬病病毒Chin

8、aⅠ，而與Clade A和C鼬獾分離株相似性分別為88％和94％左右。
　　通過(guò)病毒演化分析，推測(cè)出4個(gè)分枝毒株分化時(shí)間分別為:Clade A～1941年，Clade B～1990年，Clade C～1937年，Clade D～1997年，從分化時(shí)間的早晚及分離毒株的數(shù)量可以看出，分化越早的病毒分枝，其毒株的數(shù)量越多。
　　2.病毒全基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，鼬獾分離株(JX10-37株、JX09-17(fb)株和JX09-1

9、8株）與國(guó)內(nèi)流行毒株和疫苗株經(jīng)氨基酸比對(duì)，分別有53個(gè)、23個(gè)和25個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變，這其中有些位點(diǎn)是發(fā)生在狂犬病病毒屬內(nèi)的獨(dú)特突變（分別為27個(gè)、14個(gè)和6個(gè)）。JX09-17(fb)株在決定病毒毒力的重要基因位點(diǎn)（G蛋白抗原位點(diǎn)Ⅲ的333位）發(fā)生由精氨酸(R)到谷氨酰胺(Q)的突變。JX10-37株在較保守的G蛋白抗原位點(diǎn)Ⅰ的231位，發(fā)生由亮氨酸(L)到絲氨酸(S)的突變。
　　3.對(duì)捕獲后人工飼養(yǎng)的40只鼬獾的口服免疫

10、結(jié)果顯示，免疫后21天，F(xiàn)AVN所測(cè)免疫動(dòng)物的中和抗體均發(fā)生陽(yáng)轉(zhuǎn)(0.1-4.5 IU/mL)，重組疫苗組和弱毒疫苗組分別有17只（17/20）和16只(16/20)鼬獾，中和抗體高于0.50 IU/mL，達(dá)到臨界保護(hù)水平。
　　通過(guò)以上結(jié)果，得出以下結(jié)論:
　　1.江西、浙江等地鼬獾種群內(nèi)，存在狂犬病的獨(dú)立傳播循環(huán);至少有4種不同毒株在流行，呈明顯的地域分布;這4個(gè)分枝的病毒在不同時(shí)期由犬溢出感染鼬獾，并在鼬獾種群內(nèi)流行;

11、此外，有證據(jù)表明，鼬獾與犬可能發(fā)生交叉?zhèn)鞑ァ?br>　　2.通過(guò)對(duì)3個(gè)不同演化分枝的鼬獾分離株全基因序列分析，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了毒株中與毒力相關(guān)基因和演化相關(guān)基因的突變;氨基酸位點(diǎn)突變的多樣與復(fù)雜，說(shuō)明RABV在鼬獾種群內(nèi)流行過(guò)程中，逐漸向更適應(yīng)動(dòng)物的方向發(fā)展，同時(shí)也說(shuō)明鼬獾可能對(duì)狂犬病高度易感。
　　3.通過(guò)對(duì)鼬獾的口服免疫試驗(yàn)，證明CAV-2-E3-RGP和SRV9對(duì)鼬獾具有良好的免疫效果，免疫3周后有效抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為85％和80

12、％，說(shuō)明兩種疫苗株均可作為鼬獾口服免疫的候選株。
　　論文創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.本研究首次對(duì)我國(guó)野生動(dòng)物鼬獾狂犬病進(jìn)行系統(tǒng)的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)與分析，揭示了我國(guó)鼬獾狂犬病流行特征以及鼬獾源分離株與犬源和人源狂犬病流行株的演化關(guān)系。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)不同演化分枝鼬獾RABV流行株存在毒力相關(guān)基因和演化相關(guān)基因的重要突變，明確狂犬病病毒在鼬獾中適應(yīng)的分子基礎(chǔ)。
　　3.首次完成了鼬獾的狂犬病口服免疫試驗(yàn)，明確了我國(guó)現(xiàn)有疫苗株對(duì)