人胎盤底蛻膜間充質干細胞移植潛能相關生物學特性與向多巴胺能神經元分化的體外研究.pdf

1、研究背景: 帕金森病(PD)是以中腦黑質紋狀體區(qū)多巴胺(DA)能神經元進行性變性為主要病理特征的一類中樞慢性退行性疾病。統計學資料顯示，在65歲以上老年人群中，PD的發(fā)病率以超過1％，已躍居為僅次子阿爾茨海默病嚴重威脅老年人健康的第二大殺手。臨床上主要表現為靜止性震顫、僵直、運動遲緩和姿勢異常，晚期也將出現自主神經功能紊亂、感覺障礙、精神異常和認知障礙等非運動性癥狀，給患者身心健康、家庭和社會帶來了沉重的負擔。
　　 PD臨床運

2、動功能障礙主要是由黑質紋狀體通路中多巴胺的嚴重缺失而造成。目前藥物治療（左旋多巴）能有效恢復多巴胺水平，仍然是早期臨床治療的主旋律，但長期服用會造成嚴重的異動和精神障礙。外科手術（腦深部電刺激術）是晚期PD患者的主要治療選擇，雖然同樣能有效的控制癥狀，但手術費用昂貴，在緩解疾病進展方面也并沒有定論。
　　 近年來，細胞替代治療在退行性疾?。ㄈ?PD）治療逐漸展現出廣闊的前景。許多實驗室和臨床研究也表明替代缺失的DA神經元能改善P

3、D運動癥狀，而干細胞由于其獨特的生物學特性逐漸成為了主要的細胞來源。干細胞體外可被誘導分化為DA神經元的研究結果是細胞移植治療PD的理論基礎。胚胎干細胞(ESCs)是從發(fā)育早期胚囊內細胞團分離出來的一種未分化細胞，具有利于移植的各種優(yōu)勢，也能被誘導分化為神經干細胞(NSCs)或神經前體細胞(NPCs)，隨后進一步分化為DA神經元。盡管如此，ESC在細胞移植方面的應用面臨了巨大的限制，比如倫理束縛、易形成畸胎瘤。誘導多能干細胞(iPSCs

4、)的發(fā)現雖曾一度帶來了新的希望，但是有研究表明iPSCs比其他類型多能干細胞有更高的基因畸變頻率，意味著更容易誘發(fā)腫瘤。因此，成體干細胞又重新成為了眾多研究者們的焦點。
　　 間充質干細胞(MSCs)可以自我更新，并可分化為不同的細胞譜系，這些均是干細胞移植治療的重要特征和先決條件，在生物醫(yī)學和組織工程中具有巨大的科研價值。迄今為止，盡管在許多不同的成體組織中發(fā)現了MSCs的存在，但大多數實驗室和臨床研究都是在闡述明確且充分的骨

5、髓間充質干細胞(BMSCs)引導下進行的。然而，由于骨髓的獲取過程有創(chuàng)易出現感染，以及其數量、分化能力和基因穩(wěn)定性均隨年齡的增大而下降。因此，在過去的幾十年，探索新干細胞來源的研究從未停止過。
　　 人類胎盤是在妊娠過程中的一個暫時性器官，由分別來自于胎兒和母體的胎膜層和底蛻膜層組成。在哺乳動物妊娠過程中，胎兒被作為半異體移植體，在妊娠期并不會受到母體免疫細胞的攻擊和排斥。胎盤在這個免疫耐受過程中起到重要作用，而發(fā)揮此作用的核心

6、部位是構成母胎界面的母體蛻膜組織。有趣的是，越來越多的研究表明在足月胎盤的兩個組成部分里均含有大量的MSCs。其中，胎膜來源的MSCs(FMMSCs)由于來自胎兒而被推測具有多向分化潛能。確實，先前研究表明FMMSCs體外可被誘導分化為中胚層的心肌細胞、平滑肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞，內胚層的胰島細胞、肝細胞以及外胚層的神經元、星形膠質細胞。而且這些結果同樣在體內模型（心肌梗死和PD大鼠模型、糖尿病小鼠模型和脊髓損傷靈長類動物模型）中得

7、到了證實，進一步說明了FMMSCs移植可產生功能性效用。相反，底蛻膜來源的MSCs(decidua basalis-derived MSCs，DBMSCs)很可能由于其母體來源而極少受到關注。In't Anker等首先描述了DBMSCs的分離和擴增潛能。此外，另有研究表明DBMSCs的生長對缺氧和血清剝奪環(huán)境具有抵抗作用，可能為因局部缺血所造成的細胞凋亡提供更好的替代治療。但迄今為止，對于DBMSCs在遺傳穩(wěn)定性和增殖能力等方面的研究卻

8、鮮有，而這些特性與其移植潛能密切相關。
　　 與移植潛能相關的另一重要課題乃是移植后免疫排斥問題。免疫調節(jié)功能是MSCs用作細胞治療的一個極具吸引力的特征。重要的是，中樞神經慢性炎性反應是PD發(fā)生和發(fā)展的主要病理學基礎，許多動物實驗表明緩解黑質紋狀體區(qū)的炎癥反應是減緩DA神經元退化的有效手段。值得注意的是，炎癥雖然長期被認為是大腦修復的阻礙，但同時也可通過分泌趨化因子促使干/祖細胞募集和遷移，這也恰巧構成了干細胞移植治療PD的良

9、好微環(huán)境。相反，一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)等炎癥介質可促使蛋白異常修飾而導致錯折疊和功能缺失，進一步加劇神經退變。MSCs借助于其特有的免疫調節(jié)功能，通過細胞接觸或分泌可溶性細胞因子對有害免疫炎性組分的調控抑制黑質區(qū)微環(huán)境中的免疫活性，進而對DA神經元起到保護作用，為PD細胞移植治療打開了一扇新的窗戶。近年來，FMMSCs由于其低免疫原性（高表達HLA-G抗原、低表達HLA-Ⅱ抗原）吸引了眾多學者的目光。另外，通過分裂素或同種異

10、體細胞進行混合淋巴細胞共培養(yǎng)試驗證實FMMSCs具有免疫抑制作用。然而，在母胎免疫中發(fā)揮更重要作用的母體側蛻膜組織中的DBMSCs的免疫學特性尚未見報道。
　　 基于上述研究背景，試圖從胎盤母體側底蛻膜組織中分離并鑒定DBMSCs;從基因穩(wěn)定性、增殖能力和免疫學特性等角度分析其移植潛能;并進一步研究其體外分化為DA神經元的能力，評價其在將來PD治療方面的應用前景。
　　 第一章人胎盤底蛻膜間充質干細胞的分離及鑒定

11、　　 目的:探索有效的DBMSCs體外分離、純化方法，建立穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，并從表型和功能方面進行鑒定。
　　 方法:通過酶消化法和密度梯度離心法從人足月胎盤（37-41孕周，男性胎兒）底蛻膜中獲取間充質干細胞，采用限制性稀釋法純化獲取單細胞來源的克隆團，倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化和生長特點;流式細胞儀檢測細胞周期及表面抗原(CD14，CD29，CD31，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105，CD106)

12、的表達;免疫細胞化學檢測內皮細胞標記血管性血友病因子(vWF)、間質細胞標記波形蛋白(vimentin)、成纖維細胞標記D7-FIB、成骨細胞標記堿性磷酸酶(ALP)、成軟骨細胞標記Ⅱ型膠原蛋白(collagenⅡ)和脂肪細胞標記周脂素(perilipin)的表達，顯微鏡下隨機選取10個視野(×200)計算陽性率。在特定的誘導條件下，使其向成骨、成脂、成軟骨方向分化，鑒定其多向分化潛能。所有數據采用均數±標準差（(X)±SD）方式進行統

13、計學描述。
　　 結果:人足月胎盤底蛻膜中分離的間充質干細胞起初呈現不規(guī)則形態(tài)，僅少量貼壁生長，7天后主要呈現成纖維細胞樣長梭形，細胞生長緩慢，約在第14天形成克隆團，每個克隆團約100-200個細胞組成，大約3周后可達融合狀態(tài);傳代后細胞生長速度明顯加快，呈旋渦狀生長;經限制性稀釋培養(yǎng)后，單細胞來源的DBMSCs克隆團表現為均一的長梭形。流式細胞儀檢測結果顯示:＞70％的細胞處于靜止期（G0/G1期），且這些細胞不表達造血細胞

14、標記(CD14，CD34，CD45)和內皮細胞標記(CD31，CD106)，而典型的間充質干細胞標記(CD29，CD44，CD73，CD90，CD105)呈陽性表達。免疫細胞化學結果顯示:僅少量DBMSCs表達公認的內皮細胞標記vWF(4.0±1.2％)，而大多數細胞表達間質細胞標記vimentin（98.2±2.4％）和成纖維細胞D7-FIB（99.1±1.6％），在經誘導前成骨細胞標記ALP、成軟骨細胞標記collagenⅡ和脂肪細

15、胞標記perilipin均未見表達，而經誘導后茜素紅染色、油紅O染色和Alcian blue染色均呈陽性表現。
　　 結論:人胎盤底蛻膜雖然來源于母體，同樣含有豐富的間充質干細胞，這種細胞具備一般MSCs基本特性，包括呈克隆樣貼壁生長、表達典型的MSCs表面標記以及具有向成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞等中胚層分化潛能。
　　 第二章人胎盤底蛻膜間充質干細胞移植潛能相關生物學特性
　　 目的:通過對DBMSCs基因

16、穩(wěn)定性、增殖能力、免疫調節(jié)功能等生物學特性的深入探索，評價其在于細胞移植治療方面的應用潛能。
　　 方法:將單細胞來源的DBMSCs分兩組，一組連續(xù)培養(yǎng)3周，血球計每周計數兩次，繪制生長曲線;另一組連續(xù)長期培養(yǎng)3月，獲取晚期代數細胞。染色體核型分析早、晚期代數DBMSCs的染色體核型變化。原子力顯微鏡(AFM)、透射電鏡(TEM)觀察晚期代數DBMSCs細胞骨架結構及亞細胞超微結構。密度梯度離心法體外分離人外周血單核細胞(PBM

17、Cs)，聯合DBMSCs建立混合淋巴細胞共培養(yǎng)(MLCs)體系，在PBMCs經植物凝血素(PHA)或同種異體PBMCs刺激后，CCK-8法分析DBMSCs對PBMCs增殖抑制作用;流失細胞儀分析MLCs中淋巴細胞的凋亡情況及Treg細胞(CD4+CD25high)比例;實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)檢測MLCs中DBMSCs可溶性細胞因子轉化生長因子-β(TGF-β)、白介素-10（IL-10）、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)

18、、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、吲哚胺2，3雙加氧酶(IDO)和人類白細胞抗原-G(HLA-G)的表達情況。FMMSCs作為對照。所有數據采用均數±標準差（(X)±SD）方式進行統計學描述;多組間比較采用單向方差分析，DBMSCs體外生長動力學分析采用析因設計資料的方差分析，兩個獨立樣本的均數比較采用兩獨立樣本的t檢驗，可溶性細胞因子表達部分采用兩獨立樣本非參數秩和檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。
　　 結果:通過描繪早

19、期代數DBMSCs生長曲線圖，結果提示DBMSCs在經過11天的潛伏期后進入對數生長期，且自此往后的檢測點(d11、d14、d18、d20)，其細胞數量明顯高于FMMSCs(p＜0.05);整個過程中DBMSCs始終保持上升的生長勢頭，而FMMSCs在末期生長表現為下降的趨勢。經過3個月的長期連續(xù)培養(yǎng)，我們獲取了第16-24代晚期DBMSCs。原子力顯微鏡觀察下DBMSCs呈長梭型，部分可見大的扁平狀細胞，可見與細胞長軸平行的微絲束，細

20、胞骨架明顯，由微管、微絲、中間纖維形成立體的網狀結構，邊緣復雜，有觸突狀骨架伸出，對維持細胞的形態(tài)、細胞的運動和物質運輸起著關鍵的作用。細胞核大，核膜清晰，核仁明顯，部分細胞核可見多個核仁。細胞間連接也可見微管及微絲結構，形成細胞間的網狀連接，提示細胞間存在相互通訊和物質交換的可能。透射電鏡顯示細胞呈長梭形，細胞膜完整，在高倍鏡下，細胞表面可見散在的豐富的類似微絨毛結構，可能與胎盤固有的附著能力有關。細胞間的連接以緊密連接為主，部分區(qū)域

21、可見縫隙連接，說明細胞間存在粘合和通訊的交互作用。細胞多為單核，偶見雙核，核漿比例大，核膜清晰，外膜外表面附有核糖體，具有合成蛋白質的功能，核仁一個或多個，由核仁絲纏繞成海綿球體狀，少量的異染色質分布在核周邊區(qū)，常染色質占多數，是間期核處于伸展部位的染色質，電子密度低，利于RNA的復制，部分細胞可見核仁邊集現象，這可以使核仁合成的各種RNA更迅速的釋放在胞質中，表明細胞代謝活躍。胞漿內可見散在的粗面內質網，其上附著豐富的游離核糖體，說明

22、正在大量合成細胞分裂和生長所需的蛋白質，這從側面反應了細胞增殖活躍，細胞分化程度較低。細胞的線粒體為管狀嵴結構，與內分泌細胞的線粒體的超微結構相似。染色體核型分析結果顯示:所有受檢的晚期代數DBMSCs樣本均和早期代數細胞一樣保持正常染色體核型(46，XX);由于所有胎盤樣本均來自與男性胎兒，此結果也側面反應了我們所分離的細胞單純來源于母體組織，而并未受胎兒組織細胞的污染。MLCs實驗結果表明:無論細胞-細胞接觸方式和Transwell

23、，DBMSCs類似FMMSCs可抑制促細胞分裂素和同種異源誘導的淋巴細胞增殖，并且呈濃度依賴性。流式細胞儀AnnexinV/PI染色檢測細胞凋亡結果顯示:MLCs對照和共培養(yǎng)體系中淋巴細胞未見明顯的凋亡，兩者差異無統計學意義（t=-1.340，P=0.229）。流式細胞儀分析與DBMSCs共培養(yǎng)后CD4+CD25high細胞的變化情況，結果顯示:MLCs體系中經PHA刺激，與DBMSCs共培養(yǎng)3天后，CD4+CD25high細胞比例相比

24、對照組增高了5倍以上。Q-PCR結果提示:除TGF-β(Z=-0.289, P=0.773)外，IL-10(Z=-2.309, P=0.021)、iNOS(Z=-2.309, P=0.021)、COX-2(Z=-2.309,P=0.021)、IDO(Z=-2.309,P=0.021)和HLA-G(Z=-2.309,P=0.021)等抗炎因子的表達量相比未處理DBMSCs明顯升高，差異具有統計學意義。
　　 結論:人胎盤底蛻膜間充

25、質干細胞具有較強的增殖活性，體外長期連續(xù)培養(yǎng)可保持穩(wěn)定正常的染色體核型，且具有明顯的免疫抑制作用，是干細胞移植治療良好的細胞種子來源。
　　 第三章人胎盤底蛻膜間充質干細胞向多巴胺能樣神經元分化
　　 目的:探討人胎盤底蛻膜間充質干細胞體外分化為多巴胺能樣神經元的潛能，并分析這種潛能是否受長期培養(yǎng)影響.進而評價其在PD治療方面的應用前景。
　　 方法:采用早期第3代和經長期培養(yǎng)3個月后第19代單細胞來源DBMSC

26、s依照兩步法進行誘導。第一步:神經球(NSs)誘導，細胞換新鮮基礎培養(yǎng)基孵育過夜，胰蛋白酶消化后用含表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和B27等細胞因子的誘導培養(yǎng)基進行誘導。同時，通過光學顯微鏡下分別計數兩種不同代數細胞的成球率來評價他們的成球能力。第二步:DA神經元誘導，將NSs消化成單個細胞后，用含音猬因子(SHH)、成纖維細胞生長因子8(FGF8)、腦源性生長因子(BDNF)和毛猴素的誘導培養(yǎng)基重懸后接種于

27、層粘連蛋白包被的培養(yǎng)板中連續(xù)誘導7-10天。第一步誘導后光學顯微鏡下觀察NSs形態(tài)和生長特點，免疫細胞化學和Western blot檢測神經干細胞(NSC)標記Nestin和CD133的表達;第二部誘導后光學顯微鏡下觀察DA神經元細胞形態(tài)改變，免疫細胞化學和Western blot檢測成熟神經元標記神經特異性的烯醇化酶(NSE)、神經膠質細胞標記膠質纖維酸性蛋白(GFAP)和DA神經元特異性標記酪胺酸羥化酶(TH)的表達情況。采用圖像分

28、析軟件分析Western blot條帶灰度，以β-actin作為標準化內參。電化學-高效液相色譜法分析誘導前后培養(yǎng)上清中DA含量變化。所有數據采用均數±標準差（(X)±SD）方式進行統計學描述;早、晚期代數來源的NSs成球能力及DA神經元神經遞質分泌量比較采用兩個獨立樣本的t檢驗，早、晚期代數DBMSCs來源的DA神經元標記表達率比較采用兩獨立樣本非參數秩和檢驗，P＜0.05認為具有統計學意義。
　　 結果:當DBMSCs經過第

29、一步NSs誘導后，起初幾天大多數細胞仍呈貼壁生長，在第3天開始出現小的細胞團，這些細胞團（并非所有）體積逐漸增大，約8-10天形成漂浮生長的細胞球，第3代和第19代細胞來源的NSs光學顯微鏡下觀察形態(tài)學上無差異，免疫細胞化學檢測提示兩種不同來源的NSs均高表達神經干細胞標記Nestin和CD133，Western blot結果與免疫細胞化學結果相符。而晚期代數DBMSCs來源的NSs形成數量明顯低于早期代數來源的NSs（3.889±0.

30、674 vs6.778±0.752），差異具有統計學意義(t=4.958，p=0.000)。當NSs經過第二步DA神經元誘導后，細胞呈現出長梭形分枝狀的神經元樣形態(tài)，兩種代數來源的神經元祥細胞均表達成熟神經元標記NSE（62.250±4.935 vs56.650±6.890％，Z=-1.441，p=0.180）、神經膠質細胞標記GFAP(42.800±6.160 vs40.867±10.686％，Z=-0.641，p=0.589)和DA

31、神經元特異性標記TH（19.050±5.585 vs17.233±2.680％，Z=-0.320，p=0.818）。Western blot結果同樣證實了TH蛋白的表達，且電化學-高效液相結果顯示:相比誘導前，兩種不同來源細胞誘導后培養(yǎng)上清DA含量均有升高(P3:t=-23.002，p=0.000; P19:t=-15.756，p=0.000)，差異具有統計學意義。此外，兩種不同代數細胞誘導前后DA分泌量（P3 vs P19:156.0