單次小劑量環(huán)磷酰胺對(duì)CD4+CD25+Treg細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg細(xì)胞)占CD4+T細(xì)胞總數(shù)的5﹪-10﹪左右，在其構(gòu)成中固定表達(dá)CD25。CD4+CD25+Treg細(xì)胞在控制針對(duì)自身抗原的免疫耐受中起著重要的作用，表現(xiàn)出了其在防止自身免疫性疾病方面的重要性。因?yàn)槟[瘤相關(guān)抗原也是由自身抗原發(fā)展而來(lái)，這也就提示我們CD4+CD25+Treg細(xì)胞在幫助腫瘤逃避自身抗體的攻擊方面也許發(fā)揮著一定的作用。有證據(jù)顯示發(fā)展較快的腫瘤往往伴有CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量的

2、急劇增加。在動(dòng)物模型中我們也發(fā)現(xiàn)移除CD4+CD25+Treg細(xì)胞有助于增強(qiáng)腫瘤免疫。 現(xiàn)在已經(jīng)知道，環(huán)磷酰胺除了作為烷化劑所表現(xiàn)出來(lái)的直接性的細(xì)胞毒作用以外，還同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)方面的功能，比如它可以清除CD4+CD25+Treg細(xì)胞。在這方面，國(guó)際上研究得較多的便是小劑量環(huán)磷酰胺的作用劑量及藥效的持續(xù)時(shí)間。有研究發(fā)現(xiàn)，使用小劑量環(huán)磷酰后，第4d其作用強(qiáng)度達(dá)到最大值，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量又顯著降低，僅為正常值的50

3、﹪左右。而在第10d環(huán)磷酰胺的作用基本消失，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量也基本恢復(fù)到原來(lái)水平。 以上便是有關(guān)于環(huán)磷酰胺與CD4+CD25+Treg細(xì)胞的研究現(xiàn)狀，本次實(shí)驗(yàn)便是基于上述理論所設(shè)計(jì)的，主要從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面進(jìn)行驗(yàn)證。本次實(shí)驗(yàn)的目的即為了探討單次小劑量注射常規(guī)化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide CY)對(duì)于小鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg細(xì)胞)的影響，同時(shí)研究其在腫瘤預(yù)防方面的作用。

4、 材料和方法 實(shí)驗(yàn)分為兩大部分：A單純注射小劑量環(huán)磷酰胺的CY組小鼠及僅注射生理鹽水的對(duì)照組小鼠。在環(huán)磷酰胺注射后的第4d，用Western blotting技術(shù)檢測(cè)scurfin蛋白在兩組小鼠脾臟中的表達(dá)；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組小鼠脾臟中CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)的百分比并進(jìn)行比較。B注射完環(huán)磷酰胺24h后接種腫瘤的CY+腫瘤組及注射完生理鹽水24h后接種腫瘤的生理鹽水+腫瘤組。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每日觀察小鼠飲食、活動(dòng)及一

5、般狀況。連續(xù)測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重，分別繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和小鼠體重變化曲線，觀察CY+腫瘤組的抑瘤效果并與生理鹽水+腫瘤組進(jìn)行比較。接種后20d兩組全部小鼠處死，稱(chēng)量瘤重，取其脾臟淋巴細(xì)胞，用MTT法檢測(cè)刀豆蛋白A(conA)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖情況并進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果 1．根據(jù)流式結(jié)果統(tǒng)計(jì)，CY組CD4+CD25+Treg細(xì)胞相對(duì)數(shù)量為(1．651±0．427)﹪，對(duì)照

6、組的值為(1．280±0．447)﹪，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明CY組與對(duì)照組相比，其CD4+CD25+Treg細(xì)胞的百分比有所降低。 2．根據(jù)Western blotting結(jié)果分析，設(shè)對(duì)照組的譜帶強(qiáng)度值為1，則CY組的值為0．74±0.043，兩者之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明CY組與對(duì)照組相比，其scurfin蛋白的表達(dá)量有所降低。 3．生理鹽水+腫瘤組腫瘤生長(zhǎng)曲線較為陡直；CY+腫瘤組腫瘤生長(zhǎng)曲線比較平緩，且出瘤時(shí)間延

7、緩。 4．CY+腫瘤組小鼠體重變化不明顯，且小鼠的一般狀況較好：生理鹽水+腫瘤組小鼠體重逐漸增加，后期體重負(fù)荷較大，體重下降。 5．CY+腫瘤組小鼠脾細(xì)胞的增殖能力相對(duì)增高。 結(jié)論 1．單次低劑量環(huán)磷酰胺能有效降低正常小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。 2．單次低劑量環(huán)磷酰胺能有效降低正常小鼠體內(nèi)scurfin蛋白的表達(dá)量。 3．單次低劑量環(huán)磷酰胺的預(yù)先作用能夠有效地抑制小鼠RMA淋巴瘤的生