西洋參莖葉總皂苷抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡改善大鼠急性心肌梗死后心室重構(gòu)的研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重構(gòu)(ventricularremodeling，VR)包括梗死區(qū)擴(kuò)展、心室擴(kuò)張和非梗死區(qū)代償性肥厚，是引起AMI后心衰的病理基礎(chǔ)，與缺血后心肌細(xì)胞凋亡、肥大、延長(zhǎng)、側(cè)向滑移及心肌間質(zhì)纖維化等密切相關(guān)。心肌缺血觸發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulumstress，ERS)是引起細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)通路。ERS信號(hào)通路能誘導(dǎo)C/EBP同源

2、蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)與其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)促凋亡基因表達(dá)。我們前期研究證實(shí)，CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡途徑，參與大鼠心肌缺血/再灌注損傷及心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡，是否參與AMI后心室重構(gòu)的病理過(guò)程？尚缺少研究報(bào)道。
　　 我們前期研究發(fā)現(xiàn)，西洋參莖葉總皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、降低神經(jīng)內(nèi)

3、分泌因子的激活、調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝等改善AMI后VR; PQS可改善大鼠心肌缺血再灌注損傷，減輕離體大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，其機(jī)制和抑制過(guò)度ERS有關(guān)。PQS改善AMI后VR的作用，是否與抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡有關(guān)？以往亦缺少研究。
　　 因此，本研究采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立AMI模型，進(jìn)一步證實(shí)PQS改善AMI后VR的作用，并從CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡方面，探討PQS改善AMI后VR的分子機(jī)制;采用內(nèi)

4、質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)誘導(dǎo)離體乳大鼠心肌細(xì)胞ERS相關(guān)凋亡，觀察PQS對(duì)TG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響;以蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)重組腺病毒感染和RNA干擾(RNA interference，RNAi)方法分別過(guò)表達(dá)或敲低心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)跨膜蛋白PERK基因，探討PQS抑制ERS相關(guān)

5、凋亡的信號(hào)途徑。
　　 研究一西洋參莖葉總皂苷改善急性心肌梗死后心室重構(gòu)的作用
　　 目的:證實(shí)西洋參莖葉總皂苷對(duì)AMI后心室重構(gòu)的改善作用
　　 方法:通過(guò)結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支復(fù)制急性心肌梗死模型，術(shù)后24 h，存活的大鼠隨機(jī)分為PQS50 mg/kg/d組、PQS100 mg/kg/d組、PQS200 mg/kg/d組、?；撬?00 mg/kg/d組及AMI組（等量飲用水灌胃），每組10只。另設(shè)sham組

6、（等量飲用水灌胃）15只。4周后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室結(jié)構(gòu)及功能變化、頸動(dòng)脈插管檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)、BIOSITE Triage診斷儀測(cè)定血漿BNP含量、Evansblue和TTC染色法測(cè)定心肌梗死范圍、比色法測(cè)定非梗死區(qū)心肌組織羥脯氨酸含量。
　　 結(jié)果:與AMI組比較，低、中、高劑量PQS均可明顯降低收縮期及舒張期左室內(nèi)徑、左室舒張末壓、血漿BNP水平、心肌梗死范圍和心肌組織羥脯氨酸含量(P＜0.05），升高射血分?jǐn)?shù)、左室短軸縮短

7、率、平均頸動(dòng)脈壓、左室收縮末壓和+dp/dtmax及-dp/dtmax絕對(duì)值(P＜0.05），且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論:PQS減輕AMI后大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化、功能損傷和纖維化程度，減輕AMI后心室重構(gòu)。
　　 研究二西洋參莖葉總皂苷抑制AMI后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的作用
　　 目的:證實(shí)西洋參莖葉總皂苷抑制AMI后ERS相關(guān)凋亡的作用。
　　 方法:AMI造模后24 h，存活大鼠分組（每組10只）:AMI

8、組（等量飲用水灌胃），PQS200 mg/kg/d組、?；撬峤M(300 mg/kg/d)，另設(shè)sham組15只。4周后，TUNEL法檢測(cè)非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率，Western blotting檢測(cè)ERS分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、鈣網(wǎng)蛋白(CRT)、CHOP及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與AMI組比較，PQS200 mg/kg/d組非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡率、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78和CRT蛋白表達(dá)

9、、ERS凋亡相關(guān)分子CHOP和促凋亡蛋白Bax表達(dá)均明顯降低(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高(P＜0.05)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CHOP蛋白表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡率呈顯著正相關(guān)(r=0.797，P＜0.01)。
　　 結(jié)論:PQS通過(guò)抑制CHOP介導(dǎo)的ERS相關(guān)凋亡而減輕AMI后非梗死區(qū)心肌細(xì)胞凋亡。
　　 研究三西洋參莖葉總皂苷減輕毒胡蘿卜素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用
　　 目的:證實(shí)PQS減

10、輕ERS誘導(dǎo)劑TG誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。
　　 方法:原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為:①Control組:細(xì)胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)24 h。②TG組:培養(yǎng)液中加1μMTG，作用24h;③、④、⑤、⑥組:分別采用40μg/ml、80μg/ml及160μg/ml PQS及?；撬?0mM預(yù)處理細(xì)胞24 h后，再向培養(yǎng)液中加入1μM TG作用24h。CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活性及凋亡率，Western blotting方法檢測(cè)

11、ERS標(biāo)志分子GRP78、PERK、CHOP及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與TG組比較，PQS160μg/ml可顯著降低細(xì)胞凋亡率，升高細(xì)胞比活力(P＜0.05）;三種不同濃度的PQS均可降低GRP78、PERK、CHOP及Bax蛋白表達(dá)，升高Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.05），且呈劑量依賴性。
　　 結(jié)論:PQS160μg/ml減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)理可能與抑制過(guò)

12、度ERS相關(guān)凋亡有關(guān)。
　　 研究四西洋參莖葉總皂苷抑制PERK介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的作用
　　 目的:證實(shí)PQS通過(guò)抑制PERK-eIF2α-ATF4-CHOP減輕心肌細(xì)胞凋亡。
　　 方法:原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞分為:①Control組:細(xì)胞置CO2孵箱37℃，常規(guī)培養(yǎng)24 h。②TG組:培養(yǎng)液中加1μMTG，作用24 h;③PQS+TG組:160μg/mlPQS預(yù)處理24 h后，按照②程序操作;④PER

13、K敲低+TG組:以RNAi方法敲低心肌細(xì)胞PERK基因后，按照②程序操作;⑤隨機(jī)雙鏈RNA轉(zhuǎn)染對(duì)照組+TG組(MOCK+TG):轉(zhuǎn)染隨機(jī)合成的25bp雙鏈小RNA片段至心肌細(xì)胞后，按照②程序操作;⑥PERK過(guò)表達(dá)組:以PERK重組腺病毒感染24 h;⑦PQS+PERK過(guò)表達(dá)組:培養(yǎng)液中加入終濃度為160μg/ml的PQS預(yù)處理24 h后，按照⑥程序操作。以CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞活性及凋亡率;RT-PCR和Western b

14、lotting方法檢測(cè)ERS標(biāo)志分子GRP78、PERK、eIF2α、ATF4和CHOP的轉(zhuǎn)錄及翻譯。
　　 結(jié)果:與單純TG處理組比較，敲低PERK表達(dá)及PQS預(yù)處理均可顯著降低心肌細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞比活力，降低ERS分子GRP78、ATF4及CHOP表達(dá)，降低PERK及eIF2α的磷酸化水平(P＜0.05)。與Control組比較，單純過(guò)表達(dá)PERK可升高心肌細(xì)胞凋亡率，降低心肌細(xì)胞比活力，升高ERS分子GRP78、ATF