兔脂肪來(lái)源干細(xì)胞改善靜脈淤血皮瓣模型微循環(huán)功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言
　　靜脈淤血是皮瓣移植手術(shù)的常見(jiàn)并發(fā)癥，如不及時(shí)糾正，將會(huì)發(fā)展為靜脈危象狀態(tài)，最終造成皮瓣壞死。多年來(lái)，皮瓣靜脈危象的防治一直是整形外科的棘手問(wèn)題。皮瓣靜脈淤血是由于皮瓣的靜脈血液回流受阻，使血液淤積于小靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)，引起皮瓣外觀腫脹、呈紫色的臨床現(xiàn)象。淤血的組織微循環(huán)內(nèi)可能形成血栓，影響組織的營(yíng)養(yǎng)，最后導(dǎo)致組織的壞死，造成手術(shù)失敗。近年來(lái)，術(shù)后局部應(yīng)用肝素鹽水、水蛭素等抗凝劑，使用水蛭、機(jī)械水蛭，滾動(dòng)按摩療法，拆線、放

2、血療法，高壓氧治療，局部應(yīng)用生長(zhǎng)因子及與干細(xì)胞共用等治療治療方法，這些方法都可以取得一定的效果，但也都存在著各自的局限性。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，也為臨床上移植術(shù)后皮瓣的成活帶來(lái)了新的希望。
　　干細(xì)胞技術(shù)目前正以其無(wú)可比擬的優(yōu)越性被應(yīng)用于多種臨床研究及治療。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞因具有來(lái)源廣泛、培養(yǎng)簡(jiǎn)便、衰老水平低、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分泌具有生物活性的bFGF、VEGF、H

3、GF、TGF-β等促進(jìn)促進(jìn)血管新生的因子，已有研究指出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞具有很強(qiáng)的血管再生能力，在下肢缺血、心肌梗死及創(chuàng)傷愈合等過(guò)程中均能促進(jìn)血管形成，將其應(yīng)用于難治性創(chuàng)面也取得了良好的治療效果。在大鼠皮瓣移植模型中給予脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療能夠促進(jìn)血管新生，改善局部血供，減少皮瓣的壞死，但脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)改善靜脈淤血皮瓣微循環(huán)功能的作用機(jī)制還需繼續(xù)深入研究。
　　本研究擬分離兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，同時(shí)建立兔耳靜脈淤血皮瓣模型，觀察應(yīng)

4、用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)靜脈淤血皮瓣成活的效果以及其作用機(jī)制，探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床上預(yù)防和治療皮瓣靜脈淤血的應(yīng)用前景。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1、兔脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記
　　2、兔脂肪干細(xì)胞體外向脂肪細(xì)胞及成骨細(xì)胞的分化誘導(dǎo)
　　3、建立兔耳靜脈淤血皮瓣模型
　　4、兔脂肪干細(xì)胞的CM-Dil標(biāo)記
　　5、皮瓣組織DAPI染色
　　6、實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組皮瓣成活面積測(cè)定
　

5、　7、HE染色觀察各組皮瓣組織的病理學(xué)改變
　　8、皮瓣微血管數(shù)目測(cè)定
　　9、cd34免疫熒光檢測(cè)內(nèi)皮標(biāo)記物
　　10、RT-PCR檢測(cè)VEGF及bFGFmRNA的表達(dá)
　　11、Westernblot檢測(cè)VEGF及bFGF蛋白的表達(dá)
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、體外提取兔脂肪干細(xì)胞并進(jìn)行傳代，第3代脂肪干細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記結(jié)果顯示:CD90、CD29、CD13表達(dá)為陽(yáng)性，而CD31、CD34、C

6、D45表達(dá)為陰性;細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在第4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并于第6d達(dá)到生長(zhǎng)高峰。
　　2、兔脂肪干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化12d油紅O染色脂滴處呈紅色，成骨誘導(dǎo)分化21d茜素紅染色可見(jiàn)細(xì)胞形成典型的橘紅色鈣化結(jié)節(jié)。
　　3、皮瓣術(shù)后均出現(xiàn)滲血及腫脹，遠(yuǎn)端形成淤血，邊緣壞死，顏色暗紅。鏡下觀察可見(jiàn)真皮內(nèi)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞黏附，毛細(xì)血管及微靜脈內(nèi)存在大量的紅細(xì)胞聚集，微靜脈內(nèi)發(fā)生血栓。
　　4、體外采用CM-

7、Dil標(biāo)記脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，將標(biāo)記好的細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察，顯示為紅色熒光，標(biāo)記率達(dá)95％以上。
　　5、DAPI染色皮瓣皮下組織細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察見(jiàn)藍(lán)染細(xì)胞，標(biāo)記率達(dá)90％以上。
　　6、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞皮下注射實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，靜脈淤血皮瓣的成活面積明顯增加。
　　7、對(duì)照組真皮內(nèi)單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞黏附，毛細(xì)血管及微靜脈內(nèi)存在大量的紅細(xì)胞聚集，微靜脈內(nèi)發(fā)生血栓。而實(shí)驗(yàn)組毛細(xì)血管及微靜脈內(nèi)紅細(xì)胞聚集消散

8、，血栓程度明顯減輕。
　　8、實(shí)驗(yàn)組皮下注射ADSCs的靜脈淤血皮瓣組織微血管數(shù)目顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9、免疫熒光檢測(cè)CD34的表達(dá)與微血管數(shù)目檢測(cè)結(jié)果基本一致，即實(shí)驗(yàn)組CD34的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。
　　10、RT-PCR檢測(cè)bFGF及VEGFmRNA的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量升高，顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　11、Westernblot檢測(cè)bFGF及VEGF蛋白的表達(dá)結(jié)果與mRNA基本