精原干細胞在成骨培養(yǎng)條件下生物學特征的研究.pdf

1、目的： 1.對小鼠精原干細胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)的體外培養(yǎng)方法進行研究，觀察SSCs體外的增殖能力及生物學特性，并對細胞表面相關標志物進行檢測，以期建立體外培養(yǎng)精原干細胞的培養(yǎng)體系，為精原干細胞深入研究提供實驗模型； 2．觀察小鼠精原干細胞在成骨培養(yǎng)條件下的生物學特征，初步探討其可能機制，為研究精原干細胞的多向分化能力奠定實驗基礎，同時可為其作為組織工程種子細胞提供初步的實驗依

2、據(jù)。 方法： (1)骨髓基質(zhì)細胞飼養(yǎng)層制備：用全骨髓法分離小鼠骨髓基質(zhì)細胞。選取生后7～10 d昆明系小白鼠(雌雄不限)，無菌條件下取出脛骨、股骨，分離骨髓基質(zhì)細胞，差速貼壁法進行純化。以含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6～7 d后細胞鋪開成單層占瓶底達80％，換用含終濃度為10μg/ml絲裂霉素C的IMDM培養(yǎng)基處理，充分清洗后作為飼養(yǎng)層備用。 (2)精原干細胞的純化培養(yǎng)及其鑒定：通過兩步酶消化法從

3、新生小鼠睪丸中收集睪丸細胞并培養(yǎng)。無菌取出生后6～8 d雄性小鼠雙側(cè)睪丸，去白膜，隨后用1mg/ml IV型膠原酶37℃消化10 min，其間不斷搖動，直到生精小管散開，PBS清洗后，然后用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA在顯微鏡下控制消化時間，見生精小管段被解離成單細胞或小細胞團時，用含10％胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基終止消化，Hanks液清沈后，收集細胞，制成單細胞懸液，接種在用0.2％明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37℃，

4、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在1h、3 h、12 h經(jīng)差速貼壁法去除非精原干細胞，收集較純的精原干細胞，制備單細胞懸液接種于上述制備好的骨髓基質(zhì)細胞飼養(yǎng)層中進行培養(yǎng)；另外，接種前將少許細胞懸液滴片，進行免疫細胞化學方法檢測精原干細胞的標志物Thy-1。接種培養(yǎng)后在倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態(tài)及增殖特征，且對培養(yǎng)3d的精原干細胞用同法檢測表面標記分子Thy-1。 (3)精原干細胞在成骨培養(yǎng)條件下培養(yǎng)：取培養(yǎng)3 d的精原干細胞，用

5、0.25％的胰酶消化，制成單細胞懸液，將其加入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入濃度為5×104/ml的細胞懸液1ml培養(yǎng)24 h后，隨機分組進行培養(yǎng)。對照組：用一般培養(yǎng)液(IMDM+100 U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素+10％胎牛血清)培養(yǎng)精原干細胞，3～4 d換液1次。實驗組：用成骨條件培養(yǎng)液(一般培養(yǎng)液中添加50 mmol/L β-甘油磷酸鈉，10-6mol/L地塞米松，50mg/L維生素C，50 nmol/L胰島素，20 nmol

6、/LbFGF)誘導培養(yǎng)精原干細胞，3～4 d換液1次。 (4)結(jié)果檢測：在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學變化并照相記錄；特定時間段對細胞進行計數(shù)分析細胞增殖行為；紫外分光光度儀動態(tài)檢測培養(yǎng)上清液的堿性磷酸酶活性(Alkaline phophatase，ALP)；免疫熒光染色檢測細胞內(nèi)I型膠原的表達。(5)統(tǒng)計學分析：采用配對設計的均數(shù)t檢驗對堿性磷酸酶活性檢測所得資料進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： (1)小鼠骨髓基質(zhì)細胞

7、呈成纖維細胞樣生長，突起相互交織，6～7 d后鋪展開成單層達瓶壁底80％，經(jīng)絲裂霉素C處理后不再分裂增殖但保留了分泌功能； (2)精原干細胞在骨髓基質(zhì)細胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)3 d后開始增殖，增殖的細胞呈鏈狀、簇狀、克隆樣生長，細胞間可見明顯的由于細胞未完全分裂形成的胞質(zhì)間橋。精原干細胞接種培養(yǎng)前滴片及培養(yǎng)3 d后，檢測其表面標記分子Thv-1均呈陽性反應，且陽性率達90％以上。細胞的以上生長特點、形態(tài)學特征及免疫組化檢測均與精原干細胞

8、的特性符合。 (3)形態(tài)學特征變化：對照組SSCs從第3 d開始分裂增殖，第6 d增殖細胞呈簇狀、鏈狀生長，9 d后細胞增殖加快，12 d后細胞增殖速度明顯增加，SSCs分裂形成的每個細胞團的細胞數(shù)可達20個左右，在這些增殖的細胞中，細胞間橋仍明顯；實驗組SSCs在條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每時間段的細胞增殖均較對照組快，生長迅速的細胞，呈集落樣生長，12 d時細胞增殖達高峰，增殖細胞之間缺乏明顯的連接，未見到明顯的胞質(zhì)間橋；細胞的形態(tài)

9、呈現(xiàn)幼稚性細胞的變化，核質(zhì)比例大。 (4)實驗組細胞進行Ⅰ型膠原免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可見細胞內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，呈陽性反應；對照組呈陰性。 (5)培養(yǎng)上清液中的堿性磷酸酶活性：實驗組與對照組開始都很低，以后隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強，且實驗組每時間段均高于對照組。應用配對設計的均數(shù)t檢驗對資料進行統(tǒng)計學分析，(t=3.441，P=0.026<0.05)，有統(tǒng)計學差異。 結(jié)論： (1)以原代培養(yǎng)的小鼠