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文檔簡介
1、[目的]
B7-H4(B7S1、B7x)是最近發(fā)現的B7家族成員,能通過抑制T細胞的增殖、細胞因子的產生和細胞周期的進程來負性調控T細胞的免疫應答,其在多種腫瘤組織中的高表達,提示其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用,并被認為是某些腫瘤的新型腫瘤標志物。
本文采用免疫組織化學法檢測部分肺癌及結直腸癌組織B7-H4的表達,采用重組小鼠B7-H4(mB7-H4)蛋白作為抗原制備兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體,并建立檢測人可溶
2、性B7-H4(soluble B7-H4,sB7-H4)的ELISA夾心法,并對部分腫瘤患者血清sB7-H4水平進行檢測,以探討sB7-H4的檢測對腫瘤的診斷及預后的意義,并為研究B7-H4在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定基礎。
[方法]
1.肺癌和結直腸癌患者腫瘤組織中B7-H4的表達
采用抗人B7-H4單克隆抗體作為一抗,借助免疫組織化學法檢測20例肺癌和20例結直腸癌患者腫瘤組織中B7-H4的
3、表達。
2.兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體的制備及鑒定
用純化的重組小鼠B7-H4蛋白作為抗原,免疫家兔,制備兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體,并對其特異性及純度進行鑒定。
3.sB7-H4 ELISA檢測方法的建立
以抗人B7-H4單克隆抗體做為包被抗體,純化的重組小鼠B7-H4作為參考標準品,兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體作為捕獲抗體,HRP標記羊抗兔IgG作為二抗,建立檢測可溶性B7
4、-H4的ELISA夾心法。
4.腫瘤患者血清sB7-H4的檢測
用建立的檢測sB7-H4的ELISA法對630例不同種腫瘤患者血清sB7-H4水平進行檢測,并以正常體檢者血清sB7-H4水平作為對照,分析腫瘤患者與正常體檢者血清sB7-H4濃度的差異。
[結果]
1.肺癌和結直腸癌患者腫瘤組織中B7-H4的表達
通過免疫組織化學法檢測20例肺癌和20例結直腸癌腫瘤組織
5、B7-H4的表達,結果顯示B7-H4在肺癌和結直腸癌腫瘤組織中高表達,提示B7-H4可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。
2.兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體的制備及鑒定
成功制備了兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體,經過半飽和硫酸銨初步純化后,其ELISA效價為1:12800,多克隆抗體除與重組小鼠B7-H4蛋白結合外,還能結合人腫瘤組織中的B7-H4,其純度及特異性均達到后續(xù)試驗要求。
3.可溶性B7
6、-H4 ELISA檢測方法的建立
成功建立了sB7-H4 ELISA檢測方法,檢測范圍在3.13μg/L~200μg/L之間,批內重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數分別為7.92%和11.1%,平均回收率達到了90.1%,說明該方法的準確度和精密度都較好。
4.腫瘤患者血清B7-H4的檢測
用以上建立的方法對630例不同種腫瘤患者血清sB7-H4水平進行了檢測,結果顯示肝癌、胃癌、結直腸癌、食
7、管癌、肺癌、鼻咽癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、惡性淋巴瘤患者血清sB7-H4含量均高于正常對照,而子宮肌瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤患者血清sB7-H4與正常對照無差異。
[結論]
證實了B7-H4在肺癌及腸癌組織中高表達,其表達程度與腫瘤的病例分型和患者的臨床分期相關;成功制備了兔抗小鼠B7-H4多克隆抗體,建立了檢測sB7-H4的ELISA夾心法;初步證實了sB7-H4在多種腫瘤患者血清中含量增高。提示B7-H
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