包埋蛋白質(zhì)藥物注射用多孔微球支架的研究.pdf

1、組織工程支架的功能是為細(xì)胞的增殖提供三維空間和新陳代謝環(huán)境，并決定新生組織、器官的形狀和大小。生長(zhǎng)因子則誘導(dǎo)和刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞存活和促進(jìn)組織再生。生長(zhǎng)因子類藥物大劑量全身給藥雖然可以達(dá)到一定作用，但同時(shí)可以導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，甚至致癌。且局部雖可大劑量給藥，但由于生長(zhǎng)因子多為多肽蛋白類藥物，存在半衰期短等原因引起的不穩(wěn)定性。因此很多組織工程支架都加入生長(zhǎng)因子類藥物來刺激誘導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)或達(dá)到某種輔助治療效果。實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子在細(xì)胞支架中的

2、可控制釋放成為組織工程成功的關(guān)鍵之一。而目前蛋白質(zhì)、多肽類藥物的控緩釋給藥多采用微球載體形式，本研究結(jié)合微球制劑的制備技術(shù)工藝以及注射給藥方便易行的優(yōu)點(diǎn)，采用發(fā)泡法制備了一種包埋蛋白質(zhì)藥物注射用多孔微球作為組織工程支架。改進(jìn)了傳統(tǒng)組織工程支架需手術(shù)植入的不便，且可使藥物以一定速率緩慢釋放，提高細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)、分裂增殖的成功率和植入病變部位的便利性。 本文首先研究了以牛血清白蛋白(BSA)作為模型藥物采用復(fù)乳發(fā)泡法制備注射用多孔

3、PL,GA含藥微球支架的制備工藝及其影響因素。通過單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了制備復(fù)乳的攪拌速度、分散相聚乙烯醇(PVA)濃度、油相PLGA濃度、制備初乳時(shí)內(nèi)水相與油相體積比、均質(zhì)乳化速度以及發(fā)泡劑濃度等因素對(duì)微球形態(tài)、平均粒徑、表面孔徑大小、空隙率的影響。結(jié)果表明油相PLGA濃度、制備初乳時(shí)內(nèi)水相與油相比、發(fā)泡劑濃度、均質(zhì)乳化速度為其主要影響因素。針對(duì)主要影響因素用正交設(shè)計(jì)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化處方工藝。通過處方和工藝設(shè)計(jì)調(diào)控微孔大小和藥物在復(fù)合支架

4、中的釋放，最后得到的優(yōu)化處方微球支架平均粒徑為451μm，表面孔穴平均孔徑為20.3μm，包封率為60.08％，30天累計(jì)釋放可達(dá)84％。 以BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)分析法測(cè)定釋放介質(zhì)中的BSA的濃度，考察了微球的30天體外釋放特性，體外釋放符合Riger-Peppas模型。為了考察多孔微球支架制備工藝對(duì)模型藥物BSA穩(wěn)定性的影響，我們采用不同溶劑溶解殘存蛋白，分別測(cè)定其30天后未釋放完全的非聚

5、集蛋白含量、以非共加鍵聚集以及二硫鍵結(jié)合的變性蛋白含量。優(yōu)選微球支架體外釋放30天后殘余蛋白的測(cè)定結(jié)果表明，殘留非聚集蛋白含量約為10％，以非共價(jià)結(jié)合的聚集蛋白占總體蛋白含量2％以下，以二硫鍵結(jié)合蛋白含量占總體蛋白含量1％以下。 制備方法簡(jiǎn)便易行，且對(duì)蛋白活性影響不大。進(jìn)行NIH 3T3成纖維細(xì)胞與微球支架的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過熒光染色觀察細(xì)胞在支架中的種植和分裂增殖狀態(tài)，并同時(shí)進(jìn)行未經(jīng)染色處理的微球支架共聚焦顯微鏡觀察，作為熒光染

6、色效果空白對(duì)比。細(xì)胞熒光染色后的共聚焦顯微觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)3T3細(xì)胞能較好的吸附和種植到支架表面和孔穴中，共培養(yǎng)一周后微球支架上細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，經(jīng)過七天的培養(yǎng)分化增殖，貼壁細(xì)胞不但可以繼續(xù)牢固的在微球支架表面生長(zhǎng)附著，而且通過微球支架的表面孔徑進(jìn)入微球內(nèi)表層的細(xì)胞也可以進(jìn)一步生長(zhǎng)。 結(jié)果表明復(fù)乳發(fā)泡法制備的微球可以用作組織工程細(xì)胞載體支架，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。 結(jié)論：獲得了既能載荷細(xì)胞又能緩慢釋放蛋白類藥物的可注射多孔