Indian hedgehog過(guò)表達(dá)對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：觀察ExGe.500介導(dǎo)的India.hedgeho.(pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh)過(guò)表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的人胚軟骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，并檢測(cè)重組基因Ihh-eGFP對(duì)Ihh的功能是否具有影響。 方法：1、通過(guò)基因克隆技術(shù)將Ihh目的基因構(gòu)建入載體質(zhì)粒pSNAV2.0中，另外運(yùn)用重疊PCR技術(shù)將增強(qiáng)綠色熒光蛋白構(gòu)建入pSNAV-Ihh載體質(zhì)粒中。2、人胚軟骨細(xì)胞的分離，培養(yǎng)并通過(guò)免疫組織化學(xué)和透射電鏡觀察鑒定

2、。3、用ExGe.500將構(gòu)建好的載體質(zhì)粒pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh分別轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的人胚軟骨細(xì)胞模型中，以pSNAV空質(zhì)粒為對(duì)照，通過(guò)繪制軟骨細(xì)胞增殖曲線，MTT測(cè)細(xì)胞增殖活力，半定量RT-PCR測(cè)轉(zhuǎn)染后軟骨細(xì)胞內(nèi)Ihh及其受體Ptc的mRNA的表達(dá)差異來(lái)研究Ihh對(duì)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。 結(jié)果：1、成功的構(gòu)建了pSNAV-Ihh-eGFP及pSNAV-Ihh兩種克隆質(zhì)粒，通過(guò)菌液PCR、測(cè)序檢驗(yàn)所構(gòu)建克隆

3、無(wú)突變。2、成功分離、培養(yǎng)人胚軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)特殊染色、免疫組化染色鑒定所培養(yǎng)的人胚軟骨細(xì)胞具有正常軟骨細(xì)胞的特性。透射電鏡觀察證明所培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞具有正常軟骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。3、經(jīng)過(guò)綠色熒光顯微鏡檢測(cè)到ExGe.500介導(dǎo)的pSNAV-Ihh-eGFP在體外培養(yǎng)的人胚軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約為35％。兩試驗(yàn)組在細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力及mRNA表達(dá)方面明顯高于對(duì)照組(p<0.05)，而兩實(shí)驗(yàn)組之間無(wú)明顯差異(p>0.05)。 結(jié)論：