RegⅣ基因?qū)Y(jié)直腸癌LoVo細胞系生物學(xué)特性的影響.pdf

1、研究背景：絕大多數(shù)結(jié)直腸癌系結(jié)直腸腺瘤惡變而來的，即所謂的腺瘤．腺癌進程發(fā)展，所以獲得腺瘤差異表達基因?qū)ρ芯堪┰缙诎l(fā)生的機制尤為重要。RegIV基因是近幾年來發(fā)現(xiàn)的新的差異表達基因，它的表達較其他Reg家族基因更突出地表現(xiàn)在胃腸道；在正常結(jié)腸組織，結(jié)腸腺癌，胰腺癌，胃癌，前列腺癌中有不同水平的表達，尤其在結(jié)直腸腺瘤癌變區(qū)RegIV的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)特別明顯；而且高表達ReglV的結(jié)直腸癌細胞與耐藥及其分化表型密切相關(guān)。認為Reg IV可能是

2、癌發(fā)生的早期生物標(biāo)記物，其表達上調(diào)可能與預(yù)后差有關(guān)。但目前所有文獻僅限于對RegIV在結(jié)直腸癌及其癌前病變(腺瘤、潰瘍性結(jié)腸炎)中的上調(diào)這一現(xiàn)象的描述，而對其影響結(jié)直腸癌細胞系生物學(xué)特性及其作用機制的研究還未見有文獻報道。 目的：觀察ReglV基因在四種結(jié)直腸癌細胞系中的表達，研究ReglV陰性表達的LoVo細胞系經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RegIV基因后的表達水平改變，轉(zhuǎn)染前后LoVo細胞系的增殖能力、侵襲力、c-myc基因表達的改變；觀

3、察轉(zhuǎn)染前后RegIV基因?qū)δ[瘤化療藥物(5-Fu)抑制LoVo細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡及bcl-2基因表達的影響；同時觀察5-Fu對轉(zhuǎn)染后LoVo細胞的ReglV基因表達水平的影響，由此初步探討RegrV基因的生物學(xué)功能及其可能作用機制。 材料和方法： 1．用RT-PCR技術(shù)檢測四種結(jié)直腸癌細胞系的ReglV基因表達水平及pcDNA3.1-ReglV重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染與鑒定； 2．用MTT法檢測ReglV基因轉(zhuǎn)染

4、前后LoVo細胞的增殖活性及5-FU作用48h后的生長抑制率(IC50值)；用體外侵襲力實驗測定ReglV基因轉(zhuǎn)染前后LOV0細胞的侵襲能力改變； 3．應(yīng)用流式細胞儀和瓊脂糖凝膠電泳方法分別測定5-FU作用48h后對ReglV基因轉(zhuǎn)染前后LoVo細胞的凋亡水平； 4．用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后LoVo細胞的癌基因c-myc表達、5-Fu干預(yù)48h后ReglV表達的水平以及凋亡抑制基因bcl-2的表達變化。 結(jié)果

5、： 1．LoVo細胞系幾乎不表達ReglV基因，HT-29、CaCo-2細胞系為高表達，Sw480細胞系表達較前兩者弱。 2．成功構(gòu)建含有ReglV基因的重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-ReglV)，并轉(zhuǎn)染細胞獲得穩(wěn)定表達ReglV基因的LOV0(+)細胞。 3．ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoV0(+)細胞增殖活性弱于轉(zhuǎn)染前LoVo細胞，有顯著性差異(P<0.01)；而轉(zhuǎn)染前后LoVo細胞的侵襲力比較無明顯差異；轉(zhuǎn)染后Lo

6、Vo(+)細胞在5-Fu干預(yù)48小時后ReglV表達無明顯改變。 4．ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞在5-Fu的濃度(0.391、0.782mg/L)時生長抑制率明顯強于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細胞(P<0.01)，而在濃度大于3.125mg/L時轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞生長抑制率弱于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細胞(P<0．01)；轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞IC50值小于轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細胞。 5．ReglV基因轉(zhuǎn)染前L

7、oVo(-)細胞c-myc基因表達呈陽性，而轉(zhuǎn)染后表達明顯下調(diào)；轉(zhuǎn)染前后LoVo細胞bcl-2基因均呈陰性，5-FU(3.125mg/1)干預(yù)轉(zhuǎn)染前LoVo(一)細胞bcl-2基因呈弱表達而干預(yù)轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞bcl-2基因表達陽性。 6．在5-FU較高濃度(0.782、3.125mg/1)干預(yù)48小時后，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染前LoVo(-)細胞的凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞，瓊脂糖凝膠電泳顯示轉(zhuǎn)染前Lo

8、Vo(-)細胞梯狀條帶比轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞條帶清晰。 結(jié)論： 1、明確了四種結(jié)直腸癌細胞系的ReglV表達水平及成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染了pcDNA-ReglV； 2、ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞c-myc基因表達明顯下調(diào)，提示ReglV基因可能與c-myc基因相關(guān)： 3、ReglV基因?qū)D(zhuǎn)染前后LOV0(+)細胞增殖活性及細胞侵襲力無明顯影響； 4、ReglV基因轉(zhuǎn)染后LoVo(+)細胞在5