miRNAs在LPS誘導乳腺上皮細胞中炎性反應中的表達及miR-223參與調控Toll樣受體信號通路_初探.pdf

1、微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非蛋白編碼的單鏈小RNA，大小約20~25nt，具有高度保守性、時序表達特異性，其表達受到嚴格的調控。miRNA通過直接結合到靶mRNA分子的3'非翻譯區(qū)(3'untranslated regions,UTRs)，進行互補配對，抑制靶mRNA的轉錄、翻譯或誘導其降解，從而在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。研究表明miRNAs參與眾多生理疾病過程的調控，其表達的紊亂與疾病發(fā)生的機制密切相關。反芻動

2、物乳房炎(mastitis)，尤其是奶牛乳房炎(bovine mastitis)是世界范圍內迄今為止仍未得到有效解決的頑疾，嚴重影響了養(yǎng)殖業(yè)和乳業(yè)的發(fā)展。已有研究表明，miRNAs在乳腺炎癥反應過程中的表達有明顯變化，可能參與了乳腺炎癥反應的調控，但具體機制尚不明確。本研究旨在明確炎癥若干相關的miRNAs在LPS誘導的乳腺炎癥反應中的表達變化，對miR-223在Toll樣受體信號通路中的影響進行初探，為反芻動物乳房炎防治新靶點的發(fā)現(xiàn)提

3、供實驗依據(jù)。
　　本研究以不同濃度劑量的LPS刺激小鼠乳腺上皮(EpH4-Ev)細胞48h，qRT-PCR檢測炎癥相關miRNAs(miR-223、miR-146a、miR-181a和miR-155)的表達變化。qRT-PCR檢測結果表明，LPS誘導EpH4-Ev細胞炎癥反應48h時，4種炎癥相關miRNA的表達均顯著增加(P<0.05)，并呈現(xiàn)不同程度的劑量依賴性。利用RT-PCR方法從小鼠乳腺上皮細胞基因組DNA中對pre-m

4、iR-223基因進行克?。粯嫿艘再|粒Minicircle、PiggyBac轉座子和pcDNA3.1(+)為母本的3種miR-223真核表達載體，將其轉染整合到EpH4-Ev細胞，通過觀察GFP熒光、qRT-PCR檢測miR-223基因在EpH4-Ev細胞中的mRNA表達水平，結果表明成功構建了Mini-miR-223、PB-miR-223和pcD-miR-223三個真核表達載體。
　　為探索miR-223對炎癥反應過程中最重要的

5、信號通路—TLR信號通路相關分子的影響，我們將miR-223的過表達載體及miR-223inhibitor轉染至EpH4-Ev細胞，qRT-PCR檢測TLR信號通路相關分子表達變化，Western blot檢測其蛋白水平的變化。實驗結果表明，PB重組質粒組過表達miR-223后，與其PB空載組相比，TLR4、NF-кB、IL-6的表達水平有不同程度下調，但無統(tǒng)計學差異；MyD88、TNF-α表達明顯下調(P<0.05)；IL-1β表達明

6、顯下調，差異極顯著(P<0.001)；抑制miR-223的表達后，與上述結果基本相反，說明miR-223基因參與了TLR信號通路相關分子的調控。Western blot結果顯示：在過表達miR-223的PB組，IL-6蛋白的含量與其對照組相比，顯著下降(P<0.05)，在過表達miR-223的pcDNA3.1(+)組，IL-6蛋白的含量與其對照組相比，有下降趨勢，但無統(tǒng)計學意義；NF-кB蛋白的含量在PB和pcDNA3.1(+)兩個重組