轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導下的氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化的信號機制以及中藥天龍喘咳靈的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究目的：氣道上皮損傷、脫落及上皮下纖維化是哮喘氣道重塑重要的病理特征。研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者氣道壁網(wǎng)狀基底膜中肌纖維母細胞(myofibroblast)數(shù)量是增多的，其數(shù)量與基底膜的增厚相關。肌纖維母細胞有很強的分泌膠原和胞外基質(zhì)的能力，其因特征性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)從而具有對環(huán)境刺激產(chǎn)生收縮反應的能力，但其細胞來源尚不清楚，我們推測：氣道上皮細胞在氣道炎癥微環(huán)境因素作用下有可能向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化，從而參與了氣道高反應的發(fā)

2、生。本研究旨在探討氣道上皮細胞在轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)誘導下向肌纖維母細胞表型轉(zhuǎn)分化的可能性，以及與轉(zhuǎn)分化相關的信號轉(zhuǎn)導機制；探討中藥方劑天龍喘咳靈對肌纖維母細胞活化的標志-α-平滑肌肌動蛋白表達的影響，及其信號分子機制，為拓展其在臨床的應用以及開發(fā)以其有效組分為基礎的新型藥物奠定基礎。 研究內(nèi)容與方法：第一部分：轉(zhuǎn)化生長因子-β1體外誘導氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化的可能性1.觀察TGF-β1對氣道上皮細胞形態(tài)

3、、細胞表型標志物E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、α-SMA及細胞骨架蛋白表達的影響。 2.RT-PCR方法檢測細胞Ⅰ型膠原和纖維結合素(Fibronectin)mRNA的表達。 3.觀察TGF-β1對α-SMA啟動子活化的影響。通過瞬時轉(zhuǎn)染pSMP8質(zhì)粒(包含小鼠α-SM啟動子序列和其下游的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(CAT)報告基因)，ELISA法檢測CAT活性，觀察TGF-β1對α-SMA啟動子活化的影響。 第

4、二部分：轉(zhuǎn)化生長因子-β1誘導氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化的信號調(diào)節(jié)機制1.觀察TGF-β1對氣道上皮細胞內(nèi)smad2、smad3及p38MAPK、ERK1/2和JNK活化的影響。 2.瞬時轉(zhuǎn)染smad7表達載體，觀察其對肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化標志α-SMA表達的影響。 3.觀察p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑對TGF-β1誘導氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化的影響。

5、 4.觀察p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑對氣道上皮細胞內(nèi)smad2和smad3活化的影響。 第三部分中藥天龍喘咳靈對α-平滑肌肌動蛋白表達的影響及相關信號轉(zhuǎn)導機制1.觀察中藥(天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏)對氣道成纖維細胞α-SMA表達的影響。 2.觀察中藥(天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏)對氣道成纖維細胞內(nèi)p38MAPK、ERK1/2和smad2活化的影響。

6、 分別加入天龍喘咳靈、青天葵、淡附子和法夏預孵育2小時，再加入TGF-β1處理10min和30min，提取總蛋白，檢測細胞內(nèi)磷酸化p38MAPK、ERK1/2和smad2的蛋白表達。 結果：第一部分：轉(zhuǎn)化生長因子-β1體外誘導氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化1.正常16HBE-14o細胞未加刺激劑培養(yǎng)3天后，形成融合的單層細胞，形態(tài)呈立方形或小鵝卵石形，胞間連接緊密，具有典型的上皮細胞鋪路石樣特征；加入TGF-β110μg/L

7、作用3天后，部分細胞肥大，拉長呈梭形，細胞間隙增大，喪失其原有鋪路石樣生長方式。 2.正常對照組16HBE-14o表達微量的α-SMAmRNA，加入TGF-β1刺激48小時后α-SMAmRNA表達量增加，差異具有顯著性意義(P＜0.05)。而E-cadherinmRNA表達量隨著TGF-β1刺激時間的延長而逐漸降低，顯著低于對照組(P＜0.05)。 3.上皮細胞表型標志物E-cadherin在正常16HBE-14o細胞表

8、達強，定位在胞間連接處，而TGF-β1刺激3天后E-cadherin表達減弱，且彌散至胞漿內(nèi)。正常16HBE-14o細胞不表達肌纖維母細胞的表型標志物α-SMA，而TGF-β1刺激2天后部分細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)α-SMA表達并集合成微絲狀。正常16HBE-14o細胞F-actin表達在細胞邊緣，在外圍形成環(huán)狀帶，而TGF-β1組F-actin定位改變且重新聚合形成張力纖維(stressfibers)沿著細胞長軸分布。 第二部分：轉(zhuǎn)化生

9、長因子-β1誘導氣道上皮細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化的信號調(diào)節(jié)機制1.正常對照組核內(nèi)無磷酸化Smad2表達，smad3有微弱表達，TGF-β1刺激30min時表達量明顯增加，隨著刺激時間的延長表達量進一步增加。 2.TGF-β1刺激24h時，瞬時轉(zhuǎn)染smad7組α-SMA表達量低于相應轉(zhuǎn)染空載體組，E-cadherin表達量明顯高于相應轉(zhuǎn)染空載體組，TGF-β1刺激36h后smad7組α-SMA、E-cadherin表達量與相應空載

10、體組相似。 3.免疫熒光顯示轉(zhuǎn)染smad7組α-SMA陽性細胞數(shù)顯著低于空載體組(P＜0.05)。 4.正常對照組磷酸化p38及Erk1/2僅有微弱表達，TGF-β1刺激5min時表達量明顯增加，刺激15min、30min和1h時表達量稍有下降但仍高于正常組，24h后表達量恢復至基礎水平。正常對照組與TGF-β1刺激組都有極微弱的Phospho-JNK表達，表達量無顯著性差別。 5.加入p38MAPK和ERK1/

11、2特異性抑制劑組，絕大多數(shù)細胞F-actin和E-cadherin的表達恢復定位在細胞邊緣的正常氣道上皮細胞的特征，表達α-SMA的陽性細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)；而JNK特異性抑制劑組較之TGF-β1刺激組無明顯改變。 6.免疫印跡顯示：TGF-β1處理30min和24h，胞內(nèi)磷酸化smad2和核內(nèi)smad3的表達在p38MAPK、ERK1/2和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)特異性抑制劑組與單純TGF-β1刺激組比

12、較無明顯差異。 第三部分：中藥天龍喘咳靈對α-平滑肌肌動蛋白表達的影響及相關信號轉(zhuǎn)導機制1.RT-PCR和western免疫印跡結果顯示：單純TGF-β1刺激增強了氣道上皮下成纖維細胞表達α-SMA，天龍喘咳靈組和淡附子組α-SMAmRNA和蛋白的表達量均較單純TGF-β1組減少(P＜0.05)，其中天龍喘咳靈組α-SMAmRNA和蛋白表達量的減少程度較淡附子組明顯。青天葵和法夏兩組與單純TGF-β1組比較無明顯差異(P＞0.0

13、5)。 2.免疫印跡相應于RT-PCR的結果，天龍喘咳靈組和淡附子組磷酸化ERK1/2的表達明顯低于單純TGF-β1刺激組，而青天葵和法夏兩組與單純TGF-β1組相似。相比之下，未發(fā)現(xiàn)各藥物處理組對TGF-β1誘導的磷酸化p38和磷酸化smad2的表達具有明顯影響。 結論：1.氣道上皮細胞在TGF-β1的持續(xù)刺激下能夠向表達α-SMA的肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化，這可能作為上皮下肌纖維母細胞的一個新的來源，從而參與哮喘氣道重塑、

14、氣道高反應性的發(fā)生發(fā)展。 2.smads信號通路和MAPKs信號通路均參與了TGF-β1誘導的氣道上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程。二者可能是相對獨立，互相平行的，激活MAPK通路可獨立誘導α-SMA的表達，并不需要間接通過經(jīng)典的samds通路介導。 3.天龍喘咳靈通過降低細胞內(nèi)磷酸化ERK1/2的水平來下調(diào)α-SMA表達，從而干預上皮下成纖維細胞向肌纖維母細胞轉(zhuǎn)分化的過程，減少具有收縮反應性的氣道肌纖維母細胞的數(shù)量，降低氣道高反應性