顆粒細胞端粒酶及相關因子的表達變化對卵巢功能及卵裂球的影響.pdf

1、卵巢具有產生卵細胞和分泌激素的功能。卵巢中的卵泡與卵子發(fā)育成熟、排卵及合成和分泌激素及某些細胞因子有關，是調控女性生殖的關鍵。顆粒細胞通過縫隙連接與卵母細胞緊密接觸，對卵泡的形成和發(fā)育，及卵母細胞的營養(yǎng)和成熟起重要作用。顆粒細胞是卵巢合成和分泌抑制素、雌激素和孕激素的主要功能細胞，有高度分裂增殖的潛能。從原始卵泡生長啟動、閉鎖或排卵到黃體形成，顆粒細胞在形態(tài)、功能等方面發(fā)生了各種變化。而其增殖、分化、凋亡機制及其調控非常復雜，牽涉到復雜

2、的分子作用機制和信號傳導通路。因而研究顆粒細胞是研究卵巢功能的一個極好的切入點，而對體外受精促排卵過程中獲得的黃素化顆粒細胞進行體外培養(yǎng)，則是獲得人顆粒細胞并對其進行系統(tǒng)研究的較好的實驗方法。
　　 卵巢功能失調可導致多種婦科內分泌疾病及不孕。因而調節(jié)卵巢功能、促排卵以及不孕癥的相關治療在婦科臨床工作中具有重要意義。年齡增長和/或卵巢功能下降，可以導致卵泡閉鎖加劇，促排卵時卵巢反應性差，獲得的卵母細胞少，且卵母細胞質量下降，卵裂

3、球質量差，助孕后妊娠率低下。目前激素類藥物雖廣泛使用，并取得了顯著的療效，但仍有其局限性和副作用，特別是對年齡小而卵巢功能衰退者，其促排卵效果不好。在以往的研究中發(fā)現，信號轉導途徑中關鍵調節(jié)因子p53、p19ARF、Rb和p16在HRO軸衰老中協同變化，而預防性應用何首烏飲可通過抑制性腺軸中衰老途徑的關鍵因子而起到抗衰老的作用，何首烏飲能改善下丘腦-垂體-卵巢軸的功能。然而，何首烏飲是否以卵巢顆粒細胞為靶點，直接影響卵巢功能尚無充分證據

4、。
　　 顆粒細胞的凋亡與卵泡閉鎖有關，而端粒酶活性及相關因子的表達變化在顆粒細胞的凋亡過程中可能起重要作用，其對卵巢功能、卵裂球的發(fā)育的影響還不十分清楚。通過電耦相連的顆粒細胞和卵母細胞之間的聯系，可能代表了一種重要的信號傳導通路。顆粒細胞的去極化是卵母細胞成熟的重要特征。顆粒細胞電活動的調節(jié)為研究其細胞功能提供了一種新方法。鉀離子通道是目前發(fā)現的亞型數目最多的一類細胞膜離子通道，在調控細胞動作電位的形成、膜復極化、維持靜息電

5、位的水平以及在細胞的分泌等一系列細胞生理活動方面起著重要作用。鉀離子通道在腫瘤細胞的增殖、分化等中的研究較多，而在人卵巢顆粒細胞上的研究較少，并與顆粒細胞功能有何聯系尚不十分清楚。
　　 基于上述，本研究第一部分從進行體外受精患者的卵泡液中分離黃素化顆粒細胞，TRAP-ELISA、RT-PCR、免疫細胞化學方法測定端粒酶的活性及凋亡相關基因及蛋白的表達，探討端粒酶與凋亡相關因子對卵巢功能和卵裂球的影響；第二部分則在以前研究的基礎

6、上，為了深入了解何首烏飲對卵巢自身功能的影響，以體外培養(yǎng)的SD大鼠排卵前卵泡顆粒細胞為實驗對象，血清藥理學的方法為給藥手段，TRAP-ELISA、流式細胞術、Western blot觀察何首烏飲對顆粒細胞端粒酶活性、凋亡率和凋亡相關蛋白的影響，探討何首烏飲對其干預作用；第三部分基于少量人卵巢顆粒細胞上鉀離子通道表達的研究現狀，應用：RT-PCR方法證實人卵巢黃素化顆粒細胞存在電壓門控鉀離子通道m(xù)RNA的表達，并用化學發(fā)光法、MTT法、流

7、式細胞術、分光光度法分析其被選擇性阻滯劑4-氨基吡啶阻滯后，對顆粒細胞分泌及增殖、凋亡的影響，以期對顆粒細胞功能調控與卵泡發(fā)育、閉鎖及卵母細胞成熟等生理、病理學問題提供一些理論基礎，對不孕癥的診斷和防治提供新思路。
　　 第一部分人黃素化顆粒細胞端粒酶活性及凋亡相關基因、蛋白的表達變化對卵巢功能及卵裂球的影響
　　 目的:探討人黃素化顆粒細胞端粒酶的活性、凋亡相關基因bcl-2和p53及蛋白的表達與相應卵巢反應性和卵裂球

8、發(fā)育的關系。
　　 方法: 收集行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者卵泡液中的黃素化顆粒細胞（GCs）28例，并進行體外培養(yǎng)；根據卵泡數不同將卵巢反應性分組分為：低反應組、中反應組和高反應組；根據優(yōu)質卵裂球（胚）率進行卵裂球質量分組分為：低質量組和高質量組。端粒重復序列擴增酶聯免疫吸附分析法（TRAP-ELISA）測定顆粒細胞端粒酶活性；免疫細胞化學方法檢測顆粒細胞bcl-2和p53蛋白表達；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR

9、）測定顆粒細胞bcl-2 mRNA和p53mRNA表達。分析人黃素化顆粒細胞端粒酶的活性、bcl-2和p53蛋白及mRNA表達與卵巢反應性及相應卵裂球發(fā)育的關系。
　　 結論:
　　 1.體外培養(yǎng)的人黃素化顆粒細胞存在端粒酶活性的表達。
　　 2.黃素化顆粒細胞端粒酶活性與年齡、Gn量呈負相關，與獲卵數呈正相關，提示端粒酶活性降低與卵巢功能的下降有關。優(yōu)質卵裂球率與端粒酶活性有明顯的相關性，顆粒細胞的凋亡可能影響

10、卵母細胞的發(fā)育潛能。
　　 3.凋亡相關基因bcl-2、p53及蛋白的表達與卵巢反應性和卵裂球發(fā)育有明顯的相關性，并與端粒酶活性之間具有相關性。Bcl-2及p53基因可能參與調節(jié)端粒酶活性的表達，可作為我們研究端粒酶活性與卵巢功能關系的一座橋梁。
　　 第二部分何首烏飲含藥血清對大鼠卵巢顆粒細胞端粒酶活性及凋亡相關蛋白的影響
　　 目的:何首烏飲是具有抗衰老作用的方劑。其療效和對下丘腦-垂體-卵巢軸的調節(jié)效應已被

11、以往的實驗研究所證實。本實驗擬從卵巢顆粒細胞水平入手，了解中藥何首烏飲體內代謝產物在調節(jié)卵泡微環(huán)境過程中所起的作用，探討其對卵泡生長、發(fā)育、成熟與閉鎖的調控機制。
　　 方法:用外源性激素孕馬血清促性腺激素制備排卵前卵巢模型，收集顆粒細胞，經預培養(yǎng)后，分別與雌性SD幼鼠空白血清及含不同劑量何首烏飲的藥物血清在體外共同培養(yǎng)。TRAP-ELISA方法分析顆粒細胞端粒酶活性；運用流式細胞術分析顆粒細胞凋亡、壞死情況；Western b

12、lot檢測顆粒細胞凋亡相關基因bcl-2，bax的蛋白表達情況；分光光度法檢測顆粒細胞caspase-3活性。
　　 結論:
　　 1.何首烏飲含藥血清可上調離體培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細胞端粒酶活性，并抑制自身的凋亡。
　　 2.何首烏飲含藥血清可增加顆粒細胞內凋亡抑制基因bcl-2蛋白表達，減少促凋亡基因bax蛋白表達，這可能是其抑制顆粒細胞凋亡，防止卵泡閉鎖的作用機制之一。
　　 3.何首烏飲含藥血清可下

13、調顆粒細胞caspase-3蛋白的表達，其可能是在凋亡的較早階段，通過阻斷caspase-3的級聯裂解發(fā)揮凋亡抑制作用。
　　 4.對卵泡局部微環(huán)境的調節(jié)，可能是何首烏飲調整下丘腦-垂體-卵巢軸功能的作用靶點之一。
　　 第三部分電壓門控鉀離子通道對人黃素化顆粒細胞孕酮分泌及增殖凋亡的影響
　　 目的:用RT-PCR方法證實人卵巢黃素化顆粒細胞存在電壓門控鉀離子通道（Kv）mRNA的表達，分析其阻滯劑4-氨基吡啶

14、（4-AP）對人絨毛膜促性腺激素（hCG）誘導的顆粒細胞分泌及增殖、凋亡的作用，探討Kv對顆粒細胞功能的影響。
　　 方法:收集25例行體外受精患者卵泡液中的黃素化顆粒細胞，采用RT-PCR檢測顆粒細胞中Kv mRNA的表達。將培養(yǎng)貼壁后的顆粒細胞按干預方式分為空白組、4-AP組、hCG組和hCG+4-AP組共4組，hCG和4-AP的終濃度分別為1250 IU/L、5 nmol/L。培養(yǎng)24 h后，采用化學發(fā)光法測定各組培養(yǎng)液孕

15、酮水平；采用流式細胞術和分光光度法，以膜連蛋白Ⅴ（annexinⅤ）/碘化吡啶（PI）和caspase-3活性為檢測指標，檢測各組顆粒細胞的凋亡情況；采用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測各組顆粒細胞的增殖、抑制情況。
　　 結論:
　　 1.人黃素化顆粒細胞存在KV mRNA的表達。
　　 2.Kv阻滯劑4-AP能夠抑制人卵巢黃素化顆粒細胞基礎及hCG誘導下的孕酮的分泌。
　　 3.4-AP可抑制顆粒細

16、胞的增殖，促進顆粒細胞凋亡，其抑制顆粒細胞孕酮分泌可能與其抑制增殖、促進凋亡有關。
　　 4.Kv在卵巢黃素化顆粒細胞分泌、增殖及凋亡過程中可能起重要作用。
　　 綜上所述，我們的研究發(fā)現：（1）體外培養(yǎng)的人卵巢黃素化顆粒細胞存在端粒酶活性的表達；其端粒酶活性、凋亡相關基因bcl-2及蛋白表達與卵巢反應性、卵裂球的發(fā)育有關；（2）何首烏飲含藥血清上調離體培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細胞端粒酶活性，上調bcl-2蛋白表達、下調bax