增強(qiáng)子對(duì)提高山羊β-酪蛋白調(diào)控序列指導(dǎo)人乳鐵蛋白基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺中特異性表達(dá)水平的研究.pdf

1、人乳鐵蛋白(humanlactoferrin)又稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是人乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、體液中，具有提高免疫力，抗菌抑菌，參與鐵代謝等多種生物學(xué)功能，具有廣泛的應(yīng)用前景。從理論上說動(dòng)物乳腺組織是表達(dá)人乳鐵蛋白最為理想的器官。然而，人乳鐵蛋白基因在動(dòng)物乳腺中高效表達(dá)的報(bào)道較少。因此，如何提高人乳鐵蛋白基因在動(dòng)物乳腺中的表達(dá)水平是這方面研究的關(guān)鍵。 本文在以前實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，選用山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子、外顯子1

2、、外顯子2和內(nèi)含子1共6.7kb大小的序列作為人乳鐵蛋白乳腺特異性表達(dá)的調(diào)控序列。用PCR的方法從質(zhì)粒載體上擴(kuò)增出增強(qiáng)子DNA片段，通過xhol酶切PL18獲得hLTFcDNA片段，共同構(gòu)建了由Chickenβ-globin+山羊β-酪蛋白5'端+增強(qiáng)子+hLTFcDNA+山羊β-酪蛋白3'端組成的人乳鐵蛋白基因乳腺特異表達(dá)載體pCL25。 通過制備轉(zhuǎn)基因小鼠驗(yàn)證所獲得的乳腺特異性表達(dá)載體的表達(dá)特性。將構(gòu)建的pCL25質(zhì)粒用sa

3、i1與not1限制性內(nèi)切酶消化，回收和純化約18kb的表達(dá)載體部分，將回收的片段通過顯微注射法導(dǎo)入小鼠受精卵原核，結(jié)果獲得29只G0代小鼠，經(jīng)PCR檢測(cè)，其中1只小鼠整合有外源基因(2＃)。轉(zhuǎn)基因小鼠與正常小鼠交配，出生小鼠經(jīng)PCR篩選，獲得F1代轉(zhuǎn)基因小鼠4只(2公，2母)，F(xiàn)2代轉(zhuǎn)基因小鼠8只(母)。 采用酶聯(lián)免疫法(ELISAassay)和蛋白印跡(WesternBlot)對(duì)原代轉(zhuǎn)基因小鼠及其后代的乳汁進(jìn)行目的蛋白的表達(dá)檢

4、測(cè)。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠G0和F1、F2代乳汁中人乳鐵蛋白表達(dá)均為陽性，表達(dá)量約在6～8g/L。WesternBlot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小鼠的乳汁中所表達(dá)的目的蛋白的分子量大小約為60kDa，小于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量，相關(guān)原因有待進(jìn)一步研究。此外，對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠血液和唾液中目的蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠血液和唾液中不含有人乳鐵蛋白，說明所獲得的表達(dá)載體構(gòu)件具有較強(qiáng)的乳腺特異性。 通過本實(shí)驗(yàn)初步表明，我們所構(gòu)建的人乳鐵蛋