ATRA及其衍生物對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤,在男性中己位居所有腫瘤的第三位,女性中居第二位。2008年新增結(jié)腸癌病例有120萬,死亡病例有608,700例。隨著對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識不斷深入,治療方法的不斷創(chuàng)新,經(jīng)手術(shù)切除、化療、放療等積極治療后,改善了患者的生活質(zhì)量,但5年生存率仍無明顯提高,結(jié)直腸癌術(shù)后仍可復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,最終導(dǎo)致治療失敗甚至患者死亡。結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移若能被抑制,對腫瘤治療將有很大促進(jìn)。全反式維甲酸(all-tran

2、s retinoic acid,ATRA)已被用于治療急性早幼粒細(xì)胞性白血病,并且獲得完全緩解的療效。近年臨床應(yīng)用證實(shí),ATRA可顯著提高白血病患者5年生存率,降低復(fù)發(fā)。ATRA能否降低結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?尚不清楚。
　　ATRA為維生素 A的衍生物,是常用的誘導(dǎo)分化劑,可與細(xì)胞內(nèi)維甲酸受體(retinoic acid receptor,RAR)和維甲酸類X受體(retinoic acid X receptor,RXR)結(jié)合。這些

3、受體被激活后與靶基因中的維甲酸應(yīng)答元件(retinoic acid response element,RARE)結(jié)合,以時間、劑量依賴的方式調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),從而抑制增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡。近年研究發(fā)現(xiàn)除應(yīng)用于白血病的治療外,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)還證實(shí) ATRA及其衍生物還可促進(jìn)多種實(shí)體瘤細(xì)胞的分化,明顯抑制肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,結(jié)果表明分化誘導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移具有治療和預(yù)防作用。但ATRA可產(chǎn)生較強(qiáng)的維甲酸綜合癥。為降低

4、ATRA的毒副作用,本校藥學(xué)院在ATRA的基礎(chǔ)上合成了其衍生物:4-氨基-2-三氟甲基苯酯(4-Amino-2-Trifluoromethyl-Phenyl Retinate,ATPR),目前已證實(shí)ATPR可以抑制胃癌、肺癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　腫瘤的轉(zhuǎn)移與其粘附性降低和運(yùn)動性增強(qiáng)有關(guān),肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表達(dá)增加和活化是非肌肉細(xì)胞運(yùn)動的重要啟動因素。ZO-1

5、和occludin是最常見的緊密連接蛋白,其在細(xì)胞膜的定位決定了細(xì)胞間緊密連接狀態(tài)。低分化的腫瘤細(xì)胞同質(zhì)粘附能力降低,異質(zhì)粘附能力增強(qiáng),侵襲和遷移能力增強(qiáng),因而具有高的轉(zhuǎn)移潛能,而誘導(dǎo)分化后的癌細(xì)胞則反之,然后誘導(dǎo)分化是否能抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移?ATRA抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移,其作用機(jī)制是否通過降低細(xì)胞運(yùn)動和增加細(xì)胞粘附性而發(fā)揮?尚不清楚。
　　目前,ATRA及ATPR在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的作用及其相關(guān)機(jī)制報道極少。本課題旨

6、在探討ATRA及ATPR對結(jié)腸癌RKO細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,ATRA及其ATPR是否能降低結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移及這種作用是否與MLCK和緊密連接蛋白的表達(dá)有關(guān)。為ATRA及ATPR更好的用于結(jié)腸癌的臨床治療奠定理論基礎(chǔ)。
　　目的：研究ATRA及ATPR對結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO的增殖、凋亡、軟瓊脂克隆形成能力和遷移的影響,并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　方法：用不同濃度的ATRA和ATPR分別處理結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO細(xì)胞,MTT和細(xì)

7、胞周期檢測試劑盒檢測藥物刺激后細(xì)胞的增殖能力;Real time PCR的方法檢測ATRA和ATPR對RKO細(xì)胞增殖關(guān)鍵調(diào)控因子p21、cyclinD1 mRNA的水平。用Hoechst染色檢測ATRA和ATPR對RKO細(xì)胞凋亡的影響;Soft agar檢測RKO細(xì)胞軟瓊脂軟瓊脂克隆形成能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測兩種藥物對RKO細(xì)胞的遷移能力影響。為進(jìn)一步研究ATRA和ATPR影響RKO細(xì)胞遷移的作用機(jī)制,real time PCR和免疫熒

8、光法分析ATRA和ATPR對RKO細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)和定位;Western blot檢測 ZO-1、occludin、MLCK、MLC、MLCP、MAPK信號通路蛋白、凋亡和自噬相關(guān)蛋白、維甲酸受體和維甲酸X受體的表達(dá)。RKO細(xì)胞中分別和組合加入 ATRA,ATPR,PD98059,PMA和ML-7,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移變化。進(jìn)一步驗(yàn)證ATRA與ATPR是通過何種機(jī)制影響MLCK等分子的表達(dá)和活性,構(gòu)

9、建ERK過表達(dá)和敲除的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染入RKO細(xì)胞中,檢測ERK通路對MLCK表達(dá)的影響。構(gòu)建MLCK敲除慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入RKO細(xì)胞,分別用流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕和soft agar檢測MLCK敲除對RKO細(xì)胞增殖、遷移和軟瓊脂克隆形成能力的影響。
　　結(jié)果：ATRA和ATPR均能抑制RKO細(xì)胞的增殖,使RKO細(xì)胞周期阻滯在G1/S期,這一作用與其上調(diào)p21和下調(diào)cyclinD1 mRNA水平有關(guān)。ATRA對RKO細(xì)胞的凋亡作用不

10、明顯,進(jìn)一步分析顯示 ATRA處理后 RKO細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白beclin-1和LC3β的表達(dá)均明顯升高,抗凋亡蛋白的表達(dá)也提升。提示RKO細(xì)胞可能通過增加自噬而抵抗了ATRA誘導(dǎo)的凋亡作用。其衍生物ATPR在低濃度下即能有效誘導(dǎo)RKO細(xì)胞凋亡。Western結(jié)果顯示ATPR對自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)影響不大。ATRA和ATPR均能明顯抑制RKO細(xì)胞遷移和軟瓊脂克隆形成能力,主要與降低細(xì)胞運(yùn)動和增加細(xì)胞間緊密連接有關(guān)。結(jié)果證實(shí) ATRA和AT

11、PR抑制MLCK、MLC表達(dá)和MLC磷酸化,但是對MLCP表達(dá)沒有影響,最終使MLC磷酸化降低,細(xì)胞運(yùn)動能力降低。ATRA和ATPR上調(diào)occludin的表達(dá)并提高其在細(xì)胞膜的定位,對胞漿ZO-1的表達(dá)無明顯影響,但是膜蛋白中可檢測到兩種藥物處理后ZO-1的表達(dá)明顯增加,免疫熒光的結(jié)果也證實(shí)ATRA和ATPR可增加occludin和ZO-1在細(xì)胞膜的定位。為了進(jìn)一步明確ATRA和ATPR如何調(diào)控MLCK等分子的表達(dá),我們檢測了維甲酸受體

12、的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌RKO細(xì)胞中RARγ和RXRβ的表達(dá)很低,但是RARα、RARβ、RXRα、RXRγ均有很強(qiáng)的表達(dá)。ATRA刺激RXRβ和RXRγ表達(dá),ATPR對RARα、RARβ、RXRβ、RXRγ的表達(dá)有明顯誘導(dǎo)作用。同時,在信號通路上,ATRA和ATPR可以抑制ERK/MAPK通路。我們加入了該通路的抑制劑和刺激劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD98059與ATRA或者ATPR聯(lián)用可增加其抑制遷移的作用,相反PMA逆轉(zhuǎn)了兩種藥物遷移抑制作用。

13、為了明確ATRA和ATPR是否通過ERK通路下調(diào)MLCK的表達(dá),構(gòu)建了ERK過表達(dá)和敲除的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染入 RKO細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn) ERK1的敲除明顯抑制了 MLCK mRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步觀察ATRA和ATPR是否通過降低MLCK來減少細(xì)胞的遷移,敲除RKO細(xì)胞中MLCK的內(nèi)源性表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)RKO細(xì)胞的遷移和軟瓊脂克隆形成能力明顯受到抑制。
　　結(jié)論：ATPR具有與ATRA相同的抑制增殖、遷移和軟瓊脂克隆形成能力作用,但