他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、一、研究背景20世紀(jì)80年代以來，肝移植技術(shù)作為治療終末期肝病的有效手段迅速發(fā)展。近年來，越來越多的學(xué)者贊成肝臟移植術(shù)是治療無肝外轉(zhuǎn)移的肝臟惡性腫瘤患者的一個有效治療方法。肝癌作為肝移植的一個適應(yīng)證，居有重要地位。 Scharschmidt于80年代初統(tǒng)計世界上最大的4肝移植個中心，共540例，肝惡性腫瘤占139例，居第二位，僅次于肝硬化。截至2005年1月，我國累計施行肝移植手術(shù)已超過5000例，其中肝癌肝移植約占40％左右。

2、隨著肝移植數(shù)量的增加及經(jīng)驗的積累，肝癌肝移植的問題也逐漸成為研究的熱點。 近年肝癌肝移植取得了較好的臨床效果，其治療肝臟惡性腫瘤的療效等同于或優(yōu)于肝切除術(shù)。Cherqui等研究顯示即使癌灶＞5cm的患者，移植術(shù)后1、3年無癌生存率與小肝癌組移植術(shù)后生存率相近。Bismuth于1993年報告60例肝硬化肝癌，分肝切除與肝移植組，3年存活率雖相似(50％～47％)，但總的無轉(zhuǎn)移存活率移植組為46％，切除術(shù)僅27％(P＜0.05)，而

3、在早期小肝癌(癌塊1～2個，直徑≤3cm)則無轉(zhuǎn)移存活率移植組為83％，切除組僅18％，P＜0.001，差異極為顯著。 肝癌肝移植術(shù)后免疫抑制方案是目前全球移植界關(guān)注的問題。90年代以來，國內(nèi)外在肝臟移植免疫抑制劑的應(yīng)用已形成以CsA或FK506為主，聯(lián)合硫唑嘌呤和強(qiáng)的松的三聯(lián)用藥規(guī)范。FK506、CsA作為器官移植術(shù)后基本的免疫抑制劑，其對肝癌生長、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的影響，一直困擾著臨床肝移植界醫(yī)生。 FK506、CsA為鈣

4、神經(jīng)素抑制劑，免疫抑制作用的靶細(xì)胞主要是T細(xì)胞，它們分別與T淋巴細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)受體FKBP(FK506bindingprotein)、環(huán)孢素親和素(cyclophilin，Cyp)結(jié)合形成的復(fù)合體，與胞漿內(nèi)的神經(jīng)鈣蛋白結(jié)合，抑制其活性，從而阻止NF-ATC的核內(nèi)轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)一步抑制IL-2基因的轉(zhuǎn)錄活性，抑制T細(xì)胞的活動過程，是其發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的根本原因。 FK506、CsA對肝癌影響多為臨床觀察，對體外肝癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制探

5、討的研究較少。我們以HepG-2肝癌細(xì)胞為研究對象，通過不同濃度的FK506、CsA作用不同時間，研究對肝癌細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞周期變化及細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，應(yīng)用基因芯片技術(shù)和熒光PCR方法，從基因水平探討影向的機(jī)制。 二、本課題的研究方案1.MTT比色法觀察二者對HepG-2肝癌細(xì)胞生長的影響。 2.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)研究二者對HepG-2肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期變化的影響。 3.應(yīng)用細(xì)胞浸潤實驗觀察肝癌

6、細(xì)胞浸潤能力變化。 4.應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選FK506、CsA影響的基因，從基因水平探討影響的機(jī)制。 5.熒光PCR方法進(jìn)一步探討影響細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基因在不同濃度下對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響。 第一部分他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞生長的影響 目的：觀察不同濃度的他克莫司與環(huán)孢素A對肝癌的增殖、凋亡、細(xì)胞周期的影響。 方法：1.噻唑藍(lán)(MTT)比色法細(xì)胞生長實驗FK506濃度分別為1、5、10、50

7、、100、500μg/L，CsA濃度設(shè)為5、10、50、100、500、1000μg/L。同時設(shè)無藥對照組。分別于加藥第24、48、72h取出培養(yǎng)板，每孔加入MTT(5g/L)20μl，37℃繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl，微量振蕩器振蕩5min，用全自動酶標(biāo)儀檢測波長570nm時的吸光度值。 32.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、PCNA、細(xì)胞周期。 結(jié)果：1.FK506作用48h、72h肝癌

8、細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，當(dāng)濃度大于100μg/L，F(xiàn)K506對肝癌細(xì)胞抑制作用不明顯。 2.CsA處理48h、72h后肝癌細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。3.FK506在1-50μg/L及CsA在10-500μg/L，作用48-72h，凋亡率明顯增加，隨濃度增加，凋亡率增加，呈濃度依賴依賴關(guān)系，超過一定該濃度時，則出現(xiàn)凋亡率減低。 4.FK506在1-50μg/L對HepG-2細(xì)胞作用48h，細(xì)胞周期S期縮短和G1/G0期延

9、長，對細(xì)胞周期影響主要為阻滯于G1/G0期。CsA對細(xì)胞周期無影響。 5.FK506在1-50μg/L及CsA在10-500μg/LPCNA表達(dá)顯著減低。 第二部分基因芯片研究他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞基因的影響目的：應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞基因的影響。 方法：1.實驗分組實驗組1：CsA為300μg/L，實驗組2：K506設(shè)為20μg/L，未加藥物者為對照組。H

10、epG-2細(xì)胞分別經(jīng)過處理48h后檢測取細(xì)胞標(biāo)本行基因芯片。 2.基因芯片在深圳微芯公司實驗中心檢測。具體方法如下：總RNA提取、探針標(biāo)記、芯片雜交、芯片掃描、圖像結(jié)果分析、數(shù)據(jù)處理、報表生成。 結(jié)果：1.在CsA組中具有比較明顯的功能類別特征的基因變化是蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)，提示蛋白質(zhì)合成受到抑制； 2.在FK506組中比較突出的表達(dá)變化基因類型為與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實驗組樣品細(xì)胞存在細(xì)

11、胞增殖的抑制以及細(xì)胞凋亡的增加。 第三部分他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞的浸潤能力影響目的：探討他克莫司與環(huán)孢素A對HepG-2肝癌細(xì)胞的浸潤能力影響。 方法：1.以HepG-2肝癌細(xì)胞為研究對象，F(xiàn)K506濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/L，CsA濃度為5、10、50、100、300、500μg/L，每一濃度各設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)無藥對照組3孔，經(jīng)48h處理后行熒光光定量PCR的檢測。

12、2.細(xì)胞浸潤實驗FK506和CsA處理48h的細(xì)胞加入無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18-24h；PBS洗滌細(xì)胞2次，0.25％胰酶消化后，收集懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞數(shù)達(dá)到0.25-1.0×106/ml；取100ul細(xì)胞懸液加到浸潤膜上，37℃孵育30分鐘；每孔加入1：75配好的CyQuantGR染色劑50ul，室溫孵育15分鐘，96孔板及浸潤膜取去，行共聚焦顯微鏡檢測，測定平均熒光強(qiáng)度。 3.熒光光定量PCR的檢測：設(shè)計引物和探針、

13、細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、熒光定量PCR反應(yīng)。 結(jié)果：1.細(xì)胞浸潤實驗顯示：FK506在1-20μg/L及CsA在5-300μg/L作用48h，肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度與對照組無明顯變化，超過上述濃度范圍肝癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度較對照組明顯增強(qiáng)。 2.熒光PCR檢測：FK506在1-20μg/L，ICAM、MMP基因拷貝數(shù)與對照組無明顯差別，F(xiàn)K506濃度超過50μg/L表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)明顯增加，CsA與FK506表現(xiàn)為類似的反應(yīng)。

14、 全文結(jié)論1.FK506、CsA對HepG-2肝癌細(xì)胞有生長抑制作用，使細(xì)胞增殖能力降低，在一定濃度和作用的時間下表現(xiàn)為促細(xì)胞凋亡作用。 2.FK506使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，CsA對細(xì)胞周期無影響。 3.在CsA組中具有比較明顯的功能類別特征的表達(dá)變化基因主要包括與蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)；在FK506組中比較突出的表達(dá)變化基因類型為與細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)的基因，提示實驗組樣品細(xì)胞存在細(xì)胞增殖的抑制