Survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響及其相關的信號轉導通路.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，以腺癌最常見。由于目前尚缺乏對子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的確切分子機制的了解，嚴重阻礙了有效預防的發(fā)展。 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有調(diào)控細胞增殖和細胞凋亡的雙重作用。近年來的研究表明，它在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但其與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的關系及其對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響研究甚少。本課題從研究survivin在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細胞株中的

2、表達入手，利用RNA干擾(RNAi)技術抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中survivin的表達，并運用RT一PCR、westernblot、Brdu實驗、流式細胞儀檢測、MTT、劃痕實驗、Matrigel體外侵襲實驗等探討它在子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡和運動、侵襲過程中的作用。我們的實驗結果提示survivin在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達及其作用可能是影響子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的重要因素之一。 本課題共分四個部分：①Survi

3、vin在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達；②Survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響；③Survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞運動、侵襲能力的影響；④子宮內(nèi)膜癌細胞中EGFR／Ras／Raf／MAPK信號通路對survivin表達的調(diào)控。 第一部分Survivin在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達 目的檢測survivin在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細胞株中的表達，探討它與子宮內(nèi)膜癌的關系。 方法應用逆轉錄

4、聚合酶鏈反應(RT-PCR)、Westernblot和免疫組織(細胞)化學方法檢測survivinmRNA和蛋白在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜癌組織和細胞株Ishikawa、HEC-1一A中的表達，并比較它們之間的表達差異。 結果(1)SurvivinmRNA在正常子宮內(nèi)膜、不典型增生子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜癌組織中均有表達。SurvivinmRNA在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平顯著高于不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織

5、(均為P(O．05)。SurvivinmRNA在兩株子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa和HEC一卜A中均為強陽性表達。(2)Survivin蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平顯著高于不典型增生子宮內(nèi)膜和正常子宮內(nèi)膜組織(分別為P(O．05和P(O．01)。Survivin蛋白在兩株子宮內(nèi)膜癌細胞Ishikawa和HEC一卜A中也均為強陽性表達，與RT—PCR結果一致。Survivin蛋白在子宮內(nèi)膜癌細胞中的表達部位主要是細胞漿。 結論

6、Surviyin的過度表達可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關。 第二部分Survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的影響 目的探討survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、凋亡的調(diào)控作用及其相關機制。 方法針對survivinmRNA序列設計了三條survivin特異性的siRNAs和一條陰性對照non—targetsiRNA，并分別克隆入pRNA質粒載體。將重組質粒轉染Ishikawa細胞，用RNAi抑制Ishikawa細

7、胞中survivin的表達。采用盯一PCR和Westernblot檢測干擾效果，BrdU實驗和流式細胞儀分別檢測干擾前后細胞增殖和細胞凋亡的變化。并用Westernblot檢測了與細胞增殖密切相關的cyclinD1、cyclinE、p-RB的表達以及與凋亡密切相關的caspase一3、caspase一8、bcl一2的表達，初步探討survivin調(diào)控細胞增殖和細胞凋亡的途徑。 結果(1)成功構建了三個針對survivin基因mR

8、NA不同位點的重組質粒pRNAT—suvl，pRNAT—suv2，pRNAT-suv3和一個陰性對照質粒pRNAT—neg。其中兩個質粒pRNAT—suv2和pRNAT—suv3特異并有效地抑制了Ishikawa細胞中survivin的表達，同未轉染組和轉染pRNAT—neg組相比，surviyinmRNA的表達水平分別被抑制了(78．97±4．13)％和(80．23±5．42)％(均為P(O．01)；survivin蛋白的表達水平分別

9、被抑制了(8L61±3．45)％和(82．63±4．76)％(均為P＜0．01)。(2)RNA干擾survivin使細胞周期阻滯在G1期，顯著抑制了細胞的增殖。四組細胞的增殖率分別為：未轉染組(52．42±3．17)％，轉染pRNAT-neg組(49．67±2．52)％，轉染pRNAT-suv2組(33±2．65)％，轉染pRNAT—suv3組(34±2．0)％。干擾組與陰性對照組分別比較，差異均有顯著性(均為P＜0．01)。(3)細胞

10、周期蛋白cyclinD1和p—RB在RNA干擾后表達明顯下降，而eyclinE含量則無明顯變化。(4)RNA干擾surviyin誘導了細胞凋亡。四組細胞的凋亡率分別為：未轉染組(2．17±0．05)％，轉染pRNAT-neg組(3．99±0．17)％，轉染pRNAT—suv2組(38．48±2．13)％，轉染pRNAT-suv3組(39．39±2．55)％。干擾組與陰性對照組分別比較，差異均有顯著性(均為P(O．01)。(5)RNA干擾

11、survivin使caspase-3和caspase-8裂解增加，而bcl一2的表達無明顯變化。 結論RNAi抑制survivin的表達可以抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，并促進其凋亡，其機制可能是通過下調(diào)cyc¨nD1和p—RB蛋白的表達水平以及增加caspase一3和caspase一8的裂解引起的。 第三部分Survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞運動、侵襲能力的影響 目的探討survivin對子宮內(nèi)膜癌細胞運動、侵襲能力

12、的調(diào)節(jié)作用。 方法將第二部分構建的重組質粒pRNAT—suv2和陰性對照質粒pRNAT—neg轉染Ishikawa細胞，G418篩選穩(wěn)定并有效表達pRNAT—suv2和pRNAT-neg的克隆。用westernblot檢測穩(wěn)定表達克隆中surviyin的干擾效果，并用劃痕實驗、Matrigel體外侵襲實驗和westernblot評價穩(wěn)定并有效表達pRNAT—suv2的細胞與陰性對照組細胞運動、侵襲能力以及E一鈣粘蛋白表達的差異。

13、 結果(1)穩(wěn)定表達pRNAT-suv2的細胞其survivin的表達水平低于未轉染的細胞和穩(wěn)定表達pRNAT-neg的細胞。(2)穩(wěn)定表達pRNAT—suv2的細胞其運動能力和侵襲能力均低于未轉染的細胞和穩(wěn)定表達pRNAT-neg的細胞(p

14、表達可以降低子宮內(nèi)膜癌細胞的運動和侵襲能力，可能與E一鈣粘蛋白的表達增加有關。Survivin的異常表達可能促進子宮內(nèi)膜癌的浸潤和轉移。 第四部分子宮內(nèi)膜癌細胞中EGFR/Ras／Raf／MAPK信號通路對survivin表達的調(diào)控 目的探討子宮內(nèi)膜癌細胞中EGFR／Ras／Raf／blAPK信號通路對survivin表達的調(diào)控。 方法應用人重組生長因子EGF和TGF-Q分別作用于Ishikawa細胞，Weste

15、rnblot分析不同時間MAPK信號通路關鍵分子ERKl／2的磷酸化和survivin蛋白的表達。并且應用特異性的MAPK通路阻斷劑U0126抑制ERKl／2的磷酸化，觀察阻斷MAPK通路后survivin蛋白表達的變化。 結果(1)EGF和TGF-Q均迅速誘導了ERKl／2的磷酸化，激活了MAPK通路，并使survivin蛋白表達增加了8．35倍和9．42倍。(2)應用MAPK通路阻斷劑U0126預處理細胞則完全抑制了EGF和

16、TGF-Q誘導的ERKl／2磷酸化，阻斷了MAPK通路的激活，并使得EGF和TGF—Q上調(diào)surviyin蛋白表達的作用消失。 結論子宮內(nèi)膜癌中EGF和TGF—a能夠通過激活MAPK信號通路上調(diào)survivin蛋白的表達。MAPK通路是調(diào)控survivin蛋白表達的一個上游信號轉導通路。 綜上所述，survivin在子宮內(nèi)膜癌中過度表達，并可促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖和侵襲，抑制其凋亡。EGFR／Ras／Raf／MAPK信號