分化抑制培養(yǎng)體系支持鼠骨髓造血細(xì)胞體外擴(kuò)增及造血重建的研究.pdf

1、目的:胚胎干細(xì)胞(ES)在體外通過(guò)由鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)和白血病抑制因子(LIF)組成的分化抑制培養(yǎng)體系擴(kuò)增的同時(shí)并維持其未分化狀態(tài)和多向分化潛能。鑒于此，本研究將MEF與LIF組成的分化抑制培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增鼠骨髓造血細(xì)胞，擬達(dá)到造血祖細(xì)胞增加，又維持造血干細(xì)胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能的目的，避免HSC損耗、表型漂移、周期狀態(tài)改變、歸巢能力下降，以尋求一種安全有效的擴(kuò)增體系。 方法:采用鼠胚胎經(jīng)胰酶消化分離培養(yǎng)MEF，用絲

2、裂霉素C滅活，成功制備鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)單層，加白血病抑制因子(LIF)成為分化抑制培養(yǎng)體系。將經(jīng)密度梯度離心法分離的鼠(雄性)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)分別在分化抑制培養(yǎng)體系(MEF+LIF+IMDM)和對(duì)照組(IMDM)中培養(yǎng)7天，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)造血干/祖細(xì)胞(Sca-1+)表型、歸巢相關(guān)粘附分子VLA-4(CD49d)、VLA-5(CD49e)、LFA-1(CD11a)、HCAM(CD44)、L-selectin(CD62L

3、)，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI法測(cè)凋亡率、流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期、標(biāo)準(zhǔn)集落生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)造血活性。 結(jié)果:(1)12～14日齡的鼠胚胎組織適宜制備鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，3～5代MEF經(jīng)絲裂霉素C處理后宜用做飼養(yǎng)層。MEF飼養(yǎng)層加LIF后制備成分化抑制培養(yǎng)體系。(2)分化抑制培養(yǎng)體系明顯擴(kuò)增了BMMNC細(xì)胞總數(shù)，擴(kuò)增倍數(shù)9.78±2.1，BFU-E擴(kuò)增了11.6±1.4倍，CFU-GM擴(kuò)增了18.7±3.1倍，CFU-G

4、MMM擴(kuò)增了21.7±2.5倍。Sca-1+細(xì)胞擴(kuò)增了7.2±0.5倍，(P＜0.05)。而去掉MEF和LIF后的對(duì)照組培養(yǎng)體系BMMNC細(xì)胞總數(shù)明顯下降，CFC和Sca-1+細(xì)胞完全死亡，細(xì)胞大部分凋亡(P＜0.01)。(3)新鮮分離的BMMNC中Sca-1+細(xì)胞百分率為2.52±0.5％，分化抑制體系有效擴(kuò)增Sca-1+細(xì)胞，Sca-1+細(xì)胞占MNC百分率增加，達(dá)18.15±3.46％(P0.05)，而對(duì)照組(無(wú)MEF及LIF)第7

5、天Sca-1+細(xì)胞百分率為0(P＞0.05)。(4)擴(kuò)增前BMMNC細(xì)胞表面的CD49d和CD44表達(dá)水平高，分別為(91±2.8)％、(96±0.8)％，CD49e和CD11a表達(dá)居中，分別為(62±7.2)％、(72±6.1)％，而CD61L表達(dá)低，為(47±4.8)％，擴(kuò)增后BMMNC細(xì)胞表面各粘附分子表達(dá)如下：CD49d、CD44和CD61L表達(dá)與擴(kuò)增前相當(dāng)(P＞0.05)，而CD49e和CD11a表達(dá)明顯高于擴(kuò)增前(P＜0.0

6、5)。(5)MEF+LIF組BMMNC的凋亡率(AnnexinV+/PI-)為4.32±1.5％，而對(duì)照組BMMNC的凋亡率為84.56±12.4％(P＞0.05)，顯示分化抑制培養(yǎng)體系明顯抑制骨髓造血細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。(6)新鮮分離的BMMNC中G0/G1期細(xì)胞占80.82％，S+G2/M期細(xì)胞占19.06％，經(jīng)分化抑制體系擴(kuò)增后G0/G1細(xì)胞占80.16％，S+G2/M期細(xì)胞占20.21％，無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

7、 結(jié)論:MEF與LIF組成的分化抑制培養(yǎng)體系不僅可以在體外顯著擴(kuò)增鼠骨髓造血細(xì)胞，顯示骨髓造血細(xì)胞總數(shù)、干/祖細(xì)胞(Sca-1+細(xì)胞)及CFC均有顯著增加，并且Sca-1+細(xì)胞百分率明顯增加，未出現(xiàn)表達(dá)下降表型漂移，提示該擴(kuò)增體系有助于造血祖細(xì)胞增加，又維持造血干細(xì)胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能，未出現(xiàn)HSC損耗、表型漂移。且擴(kuò)增后的造血細(xì)胞細(xì)胞周期狀態(tài)無(wú)明顯改變，主要在G0/G1期，總體上保持其表面歸巢相關(guān)粘附分子的表達(dá)，有些粘附分子

8、表達(dá)增加，初步提示擴(kuò)增后HSC歸巢功能不會(huì)減低，可能會(huì)增強(qiáng)，但有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。故該體系有助于造血祖細(xì)胞增加，又維持造血干細(xì)胞未分化狀態(tài)和多向分化潛能，未出現(xiàn)HSC損耗、表型漂移、周期狀態(tài)改變、歸巢能力下降，顯示分化抑制體系是一種安全、有效的擴(kuò)增體系，但需進(jìn)一步體內(nèi)研究證實(shí)。 目的:利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行體內(nèi)分析造血干/祖擴(kuò)增效果是目前最可靠的HSC數(shù)目與功能的評(píng)價(jià)方法。收集本研究第一部分在體外經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴(kuò)增后來(lái)自雄性供體的鼠

9、骨髓造血細(xì)胞，移植給相同遺傳背景的雌性小鼠，觀察其歸巢、造血重建情況，檢測(cè)體內(nèi)歸巢、造血重建來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增效果，從而更加科學(xué)評(píng)價(jià)分化抑制培養(yǎng)體系的擴(kuò)增效果。 方法:收集經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增的雄性BALB/C小鼠骨髓造血細(xì)胞，雌性受者BALB/C小鼠術(shù)前5天飲用抗生素溶液腸道消毒，在武漢協(xié)和醫(yī)院腫瘤中心行60Co照射(總劑量為9.0Gy,分兩次，每次4.5Gy間隔3小時(shí))，6小時(shí)后按下列分組移植：A組(n=12)：擴(kuò)增后的鼠骨髓

10、造血細(xì)胞1×106/只經(jīng)尾靜脈注射；B組(n=12)：未擴(kuò)增即新鮮分離的鼠骨髓造血細(xì)胞1×106/只經(jīng)尾靜脈注射；C組(n=10)：尾靜脈注射0.3ml～0.5mlPBS/只。移植后24小時(shí)，取小鼠雙側(cè)股骨及脛骨，用PBS沖洗骨髓腔，裂解紅細(xì)胞后，制成骨髓細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)備用，雙側(cè)股骨及脛骨的骨髓細(xì)胞占總骨髓細(xì)胞數(shù)25％，由此計(jì)算得到總骨髓細(xì)胞數(shù)，將骨髓細(xì)胞懸液涂片，用FITC標(biāo)記的鼠Y-染色體探針FISH方法檢測(cè)Y染色體陽(yáng)性細(xì)胞百分率，

11、每張涂片至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，歸巢率=Y染色體陽(yáng)性細(xì)胞百分率×總骨髓細(xì)胞數(shù)/移植細(xì)胞數(shù)。移植后存活的小鼠第3、6、9、12、15、18、25、32、42天斷尾取血，用日產(chǎn)8000型自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定外周血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板。 結(jié)果:(1)9.0Gy照射后小鼠，尾靜脈注射PBS組全部死亡，平均存活時(shí)間6.4天，而注射擴(kuò)增骨髓造血細(xì)胞組和未擴(kuò)增即新鮮分離的骨髓造血細(xì)胞組小鼠均能長(zhǎng)期存活。(2)移植后24小時(shí)，制備骨髓細(xì)胞懸液

12、涂片,FISH檢測(cè)Y染色體陽(yáng)性雄性供者細(xì)胞百分率，F(xiàn)ITC標(biāo)記Y染色體探針，在OlympusBX60熒光鏡下WB濾片下可發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)有綠色熒光的雄性供者來(lái)源的陽(yáng)性細(xì)胞。經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴(kuò)增的骨髓造血細(xì)胞歸巢率為15.6±1.3％，而未擴(kuò)增的骨髓造血細(xì)胞歸巢率為4.6±0.3％(P＜0.05)。(3)移植后存活小鼠第3、6、9、12、15、18、32、42天經(jīng)斷尾取血，檢測(cè)外周血的白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血小板(PLT)，正常B

13、ALB/C小鼠血象WBC(6～9.2×103/ul)、RBC(9.6～11.4×106/ul)、PLT(10.9～13.8×105/ul)，經(jīng)分化抑制培養(yǎng)體系擴(kuò)增后的骨髓造血細(xì)胞移植后9天恢復(fù)白細(xì)胞到正常水平，而未擴(kuò)增的骨髓造血細(xì)胞移植后需要32天才能恢復(fù)到正常值低限,且9～32天前者白細(xì)胞水平明顯高于后者(P＜0.05)。移植擴(kuò)增的骨髓造血細(xì)胞后能有效改善貧血，其紅細(xì)胞水平在12～15天明顯高于未擴(kuò)增組(P＜0.05)，移植擴(kuò)增骨髓造

14、血細(xì)胞后能有效恢復(fù)血小板，其血小板水平在12～32天明顯高于未擴(kuò)增組.(P＜0.05)。 結(jié)論:用分化抑制培養(yǎng)體系體外擴(kuò)增的鼠骨髓造血細(xì)胞，移植給致死照射的同系小鼠，其歸巢率增加，明顯加快恢復(fù)受體小鼠外周血的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板。分化抑制培養(yǎng)體系支持鼠骨髓造血細(xì)胞體外擴(kuò)增、歸巢及造血重建，體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示它是一種良好的擴(kuò)增體系。初步顯示分化抑制培養(yǎng)體系有助于造血調(diào)控研究、造血干細(xì)胞移植，是一種安全有效的擴(kuò)增體系，為下一步人源