阿霉素誘導(dǎo)人膽管癌細(xì)胞系耐藥株的建立及其生物學(xué)特性評(píng)價(jià).pdf

1、目的：多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是腫瘤化學(xué)治療的主要障礙，使得膽管癌的化學(xué)治療效果差，本研究擬在源于人的肝門部膽管 癌原發(fā)灶的膽管癌細(xì)胞系FRH-0201的基礎(chǔ)上建立膽管癌細(xì)胞阿霉素耐藥株 FRH一0201/Adm，并研究其生物學(xué)特性，為探討惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)化療耐藥的 機(jī)制并且體外逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的新方法，克服當(dāng)前化學(xué)治療腫瘤中存在的這 一主要障礙奠定一個(gè)研究的基礎(chǔ)平臺(tái)。 方法：選擇我們建

2、立并已經(jīng)傳代的原發(fā)肝門部膽管癌細(xì)胞系(FRH－0201)，已傳至第120代，細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，用2μg/ml阿霉素 (adri amycin，ADM)間歇性作用誘導(dǎo)法逐漸篩選出耐藥細(xì)胞，最終建立了能在1μg/ml阿霉素濃度的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)并傳代的膽管癌細(xì)胞阿霉素耐藥株FRH-0201/Adm。以FRH-0201為對(duì)照，通過光鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，通 過MTT繪制生長(zhǎng)曲線觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律和倍增時(shí)間；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的腫瘤標(biāo)志物

3、CAl9-9和CAl25的變化情況；用MTT法檢測(cè)耐藥性即耐藥指數(shù)的改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期分布的變化；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)了mdr1基因mRNA表達(dá)量。免疫組織化學(xué)抗體染色檢測(cè)細(xì)胞表面耐藥 基因(mdr1)的表達(dá)產(chǎn)物p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gP)表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)阿霉素藥物濃度的變化以觀察癌細(xì)胞的膜蛋白的功能變化情況。 結(jié)果：與FRH-0201細(xì)胞相比較，F(xiàn)RH-0201/Adm細(xì)胞的

4、形態(tài)沒有明顯的變化，倍增時(shí)間延長(zhǎng)約3h；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢腫瘤標(biāo)記物：耐藥株與原細(xì)胞系分別為：CA125為9.1 4u/ml，8.60u/ml；MTT法檢測(cè)耐藥性即耐藥指數(shù)，該細(xì)胞對(duì)阿霉素藥物耐藥，F(xiàn)RH-0201-Adm對(duì)阿霉素的耐藥指數(shù)是親本細(xì)胞的約8倍；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的周期分布，S期細(xì)胞增多16.89％，G1期細(xì)胞減少29.33％、G2期細(xì)胞增多12.46％；逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)，細(xì)胞的mdr1基因表達(dá)增加約10.295倍，細(xì)胞表

5、面的多藥耐藥蛋白p-gp的表達(dá)顯著增加；磁共振共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示。然后計(jì)算平均值，親本細(xì)胞株FRH-0201和耐藥細(xì)胞株FRH-0201/ADM的熒光強(qiáng)度平均值分別為1764.8和305.4，相差5.2倍。 結(jié)論：FRH-0201/Adm細(xì)胞是源于原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞的耐藥細(xì)胞株，具有耐藥性，p-gp的過表達(dá)可能參與了細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥，能夠用于膽管癌術(shù)后化療耐藥機(jī)制的探討，并可以進(jìn)一步研究耐藥的逆轉(zhuǎn)