NMDA受體主亞基M3M4環(huán)自身免疫抗興奮毒性研究.pdf

1、該課題主要針對NR主亞基NR1的抗原性、免疫原性及其抗體對興奮性神經(jīng)元損傷的保護作用進行充分的研究論證,為興奮毒性腦損傷免疫干預提供實驗基礎.主要實驗內(nèi)容如下:一NR1激動劑結(jié)合區(qū)域片段表位分析;采用生物信息學方法對人NMDAR主亞基NRla上兩個受體激活相關多肽片段P1(第一跨膜區(qū)前)、P2片段(第三、四跨膜域之間)的理化特性與抗原性進行了分析.二M3M4環(huán)靶片段特異性單抗表位分析;為了進一步獲得M3M4片段的表位信息,我們以單克隆抗

2、體MAB363(識別表位位于人NR1分子M3M4環(huán))淘篩噬菌體展示隨機12肽庫,對篩選克隆進行特異性ELISA檢測和競爭結(jié)合實驗分析.三M3M4片段免疫應答檢測及抗血清的抗興奮毒性作用與機制探討;(一)M3M4片段免疫應答檢測;(二)M3M4片段抗血清抗興奮毒性損害作用;(三)單克隆抗體MAB363抗興奮毒性損害作用;(四)單克隆抗體MAB363抗興奮毒作用機制探討.四抗M3M4單鏈抗體庫的構建與篩選;單抗多為鼠源性,其Fc段是引起人體

3、排異反應的主要部分,我們決定構建鼠源抗NMDAR功能表位的單鏈抗體(scFv).利用全套噬菌體抗體表面展示技術,從重組人NR1 M3M4環(huán)免疫的小鼠脾淋巴細胞中提取總RNA,并純化出mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用抗體可變區(qū)PCR混合引物進行全套抗體重、輕鏈可變區(qū)(VH和VL)基因擴增.綜上所述,我們利用生物信息學預測得出NR1主亞基P2片段上存在若干B表位,容易成為免疫干預的靶點;以單抗MAB363篩選噬菌體隨機展示肽庫,結(jié)合表位肽競爭

4、性ELISA分析獲得其識別表位,且與生物信息學預測結(jié)果吻合,提示該表位可能是NR1膜蛋白M3M4環(huán)靶片段上一個重要的B細胞主表位;進一步的動物實驗證明M3M4環(huán)重組肽具有免疫原性,陽性血清和單抗MAB363具有體外抗興奮毒作用,其機制可能與抑制鈣離子內(nèi)流、影響細胞內(nèi)蛋白質(zhì)二級結(jié)構有關;構建抗M3M4重組肽的ScFv抗體庫,篩選并獲得抗M3M4和表位肽的陽性ScFv抗體.以上工作為免疫干預NMDAR治療興奮毒性神經(jīng)損傷打下了重要基礎,相關