mIL-10基因轉(zhuǎn)染修飾骨髓間充質(zhì)干-祖細胞在H-2單倍型骨髓移植aGVHD模型中的免疫生物學研究.pdf

1、目的：①小鼠骨髓間充質(zhì)干/祖細胞體外培養(yǎng)體系的優(yōu)化及相關(guān)生物學研究；②mIL—10重組復制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建制備及轉(zhuǎn)染mMSC/MPC表達；③mIL—10基因轉(zhuǎn)染修飾骨髓間充質(zhì)干／祖細胞在H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型中的生物免疫學效應(yīng)。 方法：⑴無菌剝離SPF級雌性C57BL/6小鼠股骨與脛骨，以培養(yǎng)基反復強力沖洗并刮擦髓腔內(nèi)膜后收集沖洗液，加入碎骨片振蕩沖洗，過200目濾網(wǎng)制備為單細胞懸液。分別以3種完全培養(yǎng)基（低糖

2、DMEM完全培養(yǎng)基，低糖DMEM/MCDB201完全培養(yǎng)基，Mesencult完全培養(yǎng)基）重懸，以1×106/c㎡的密度接種于25c㎡濾膜培養(yǎng)瓶，轉(zhuǎn)細胞培養(yǎng)箱，37℃，5% CO2，100%飽和濕度條件下培養(yǎng)。24小時后全量換液，去除未貼壁細胞，此后每3日換液一次。鏡下貼壁細胞約70%—80%匯合時消化，以2．5～5×103/c㎡密度接種傳代。對不同代數(shù)的培養(yǎng)細胞進行如下檢測：倒置顯微鏡下形態(tài)學特點觀察；不同培養(yǎng)體系小鼠成纖維細胞樣集落

3、形成單位（CFU—F）的檢測；計數(shù)繪制細胞生長曲線及倍增時間；流式細胞儀細胞周期檢測；流式細胞儀檢測細胞表面標記；體外定向誘導向成骨、成脂肪分化，鑒定多向分化潛能；RT—PCR法檢測細胞mIL—10mRNA；雙抗體夾心ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中mIL—10。采用SPSS11．5 FOR WINDOWS統(tǒng)計處理軟件分析，檢驗水準α=0．05。⑵以pORF5—mIL—10質(zhì)粒為模板，PCR擴增回收mIL—10 cDNA，經(jīng)一系列酶切和連

4、接反應(yīng)，將其定向插入腺病毒載體pSGCMV中，構(gòu)建pSGCMV—mIL10質(zhì)粒；此質(zhì)粒與5型腺病毒質(zhì)粒pBGHE3通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，經(jīng)胞內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組復制缺陷型腺病毒Ad5—mIL—10；經(jīng)純化后的Ad5—mIL—10在HEK293細胞中大量擴增，并通過氯化銫密度梯度離心法純化，制備病毒液，50%組織培養(yǎng)感染劑量法（TCID50）測定病毒滴度；以Ad5—EGFP腺病毒確定轉(zhuǎn)染mMSC

5、/MPC的最宜感染復數(shù)（MOI），Ad5—mIL10腺病毒體外轉(zhuǎn)染mMSC/MPC；RT—PCR法檢測Ad5—mIL10轉(zhuǎn)染mMSC/MPC后mIL10的mRNA表達，ELISA法檢測Ad5—mIL10轉(zhuǎn)染mMSC/MPC培養(yǎng)上清中mIL—10。⑶以雌性C57BL/6小鼠為供鼠，雄性F1（CB6F1）小鼠為受鼠，建立H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型：對受鼠進行直線加速器6mvX射線一次性全身照射，總劑量12Gy，劑量率100cGy/m

6、in。制備供鼠1：0，1：1，1：2，1：3四種比例的骨髓單個核細胞（MNC）／脾MNC混合懸液（骨髓MNC取1×107/只），每比例為一實驗組（n=15）。受鼠于照射后4小時內(nèi)經(jīng)尾靜脈回輸相應(yīng)混合懸液，移植后進行一般情況觀察，定期體重監(jiān)測、外周血象及嵌合體測定，GVHD臨床綜合評分，組織病理學半定量評分，以綜合評判各組aGVHD效應(yīng)，最終確定引出理想aGVHD狀態(tài)的相關(guān)參數(shù)，建立H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型；選擇1×105/只和

7、5×105/只兩個劑量梯度作為MSC/MPC移植劑量，在H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型中，分別以MSC/MPC及mIL—10基因轉(zhuǎn)染修飾的MSC/MPC進行共移植實驗，對相應(yīng)的4個共移植實驗組及aGVHD對照組進行移植后一般情況觀察，定期體重監(jiān)測，外周血象及嵌合體測定，GVHD臨床綜合評分，組織病理學半定量評分，對各組GVHD狀況進行綜合評價，并選擇移植后14天、28天、35天、60天及瀕死前等不同的時間點，采集制備各組實驗鼠血清，

8、以ELISA法進行mIL—10、mIL—4、mINF—γ及mTNF—a定量檢測。采用SPSS11．5 FOR WINDOWS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，檢驗水準α=0．05。 結(jié)果：①收集經(jīng)骨片沖洗的小鼠骨髓沖出液接種培養(yǎng)，經(jīng)傳代培養(yǎng)3代以上后細胞呈現(xiàn)為均質(zhì)性較好的短梭形細胞，漩渦或放射狀生長；優(yōu)化選擇Mesencult完全培養(yǎng)基為MSC/MPC培養(yǎng)體系；細胞可傳代生長10代以上保持生物學特性穩(wěn)定，選擇P3代培養(yǎng)細胞為實驗用細胞；對數(shù)生長

9、期的群體倍增時間（Td）為31．1±0．6小時；細胞匯合80%—90%時G0/G1期細胞百分率80．3%，G2期細胞12．40/0，S期細胞7．3%；P3代細胞表面抗原高表達CD29、CD44、CD105、Sca—1，極低表達CD45，低到中度表達CD31；P3代細胞經(jīng)體外定向誘導培養(yǎng)，可分化為成骨及脂肪細胞，證實所培養(yǎng)細胞具備多向分化潛能；RT—PCR法檢測培養(yǎng)細胞mIL—10mRNA，雙抗體夾心ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中mIL—

10、10，均未能證實mMSC/MPC體外表達分泌mIL—10。②擴增產(chǎn)物經(jīng)酶切鑒定、PCR擴增、DNA測序均證實為小鼠白介素10；構(gòu)建制備的重組腺病毒Ad5—mIL—10經(jīng)PCR鑒定正確，滴度達2．5×1010pfu/ml；Ad5—mIL—10以最宜MOI值200轉(zhuǎn)染mMSC/MPC時能獲得高效穩(wěn)定的體外表達，符合體內(nèi)實驗要求。③雄性F1（CB6F1）小鼠為受鼠，經(jīng)直線加速器6mvX射線一次性全身照射（總劑量12Gy，劑量率100cGy/m

11、in），接受雌性C57BL/6供鼠1×107骨髓MNC/3×107脾MNC（每只）聯(lián)合輸注時，可在相對集中的時間內(nèi)（+24d～+28d）穩(wěn)定地引出典型aGVHD，臨床及病理程度較一致，死亡時間相對集中（+27d～+33d），以此為參數(shù)建立H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型；體內(nèi)共移植實驗結(jié)果顯示：以1×105/只MSC/MPC共移植時可降低aGVHD的發(fā)生及嚴重程度（P<0．05），提高細胞劑量（5×105/只）并不能增強實驗效應(yīng)（P>

12、0．05）；同細胞劑量的mIL—10基因轉(zhuǎn)染修飾MSC/MPC共移植能更為顯著地減低aGVHD的發(fā)生及嚴重程度（P<0．01），但并不能降低甚至可能會加重cGVHD的發(fā)生及嚴重程度，提高細胞劑量其效應(yīng)無顯著差別（P>0．05）。細胞因子檢測顯示：MSC/MPC共移植在+14d明顯上調(diào)受鼠體內(nèi)IL—4水平（P<0．01），對IL—10影響不顯著（P>0．05），同時明顯減低INF—γ和TNF—a水平（P均<0．05）；mIL—10基因轉(zhuǎn)染

13、修飾的MSC/MPC共移植較MSC/MPC更高地上調(diào)了受鼠體內(nèi)IL—10水平（P<0．01），同時協(xié)同上調(diào)IL—4水平（P<0．05），更顯著地減少了INF—γ生成（P<0．01），但IL—10水平的上升可能也增加了受鼠發(fā)生及加重cGVHD的風險。 結(jié)論：⑴成功分離、培養(yǎng)了正常C57BU6小鼠的骨髓間充質(zhì)干/祖細胞，生物學特性穩(wěn)定，具有良好的增殖能力和向成骨、脂肪細胞的分化潛能，可用于進行基因轉(zhuǎn)染修飾及應(yīng)用于動物模型。⑵成功構(gòu)建

14、了重組AD5—mIL—10復制缺陷型腺病毒載體系統(tǒng)，并證實對mMSC/MPC具有較高的轉(zhuǎn)染效率并獲得高效穩(wěn)定的體外表達。⑶成功建立了雌性C57BL/6小鼠→F1（CB6F1）雄性小鼠方向的H—2單倍型骨髓移植aGVHD模型。1×105／只MSC/MPC共移植可降低aGVHD的發(fā)生及嚴重程度，提高細胞劑量（5×105只）并不能增強效應(yīng)。不同程度地上調(diào)受鼠IL—4水平（但對IL—10影響不顯著），同時明顯減低INF—γ和TNF—a水平，這可

15、能是MSC/MPC移植減輕aGVHD的機制之一。1×105/只mIL—10基因轉(zhuǎn)染修飾MSC/MPC共移植能更顯著地減低aGVHD的發(fā)生及嚴重程度，但并不能降低甚至可能會加重cGVHD的發(fā)生及嚴重程度，提高細胞劑量其效應(yīng)無顯著差別；mIL—10基因轉(zhuǎn)染修飾MSC/MPC較未修飾者更高地上調(diào)了受鼠IL—10水平，同時協(xié)同上調(diào)體內(nèi)IL—4水平，更為顯著地減少INF—γ生成，可能是最終顯著降低aGVHD發(fā)生及嚴重程度的原因，但IL—10水平上