心臟連接蛋白43羧基末端相互作用蛋白的酵母雙雜交篩選.pdf

1、研究背景:連接蛋白43(connexin43,Cx43)是心臟表達(dá)最豐富的連接蛋白,主要分布在心室,其構(gòu)成的縫隙連接(gap junction,GJ)在心肌細(xì)胞中的電耦聯(lián)及化學(xué)信息交流(縫隙連接通道介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊)中起著非常重要的作用。GJ通道功能的正常是心臟正常功能發(fā)揮的重要保證。近年來的研究亦表明細(xì)胞間電耦聯(lián)障礙是心律失常的另一個(gè)重要原因,其所起的致心律失常作用甚至比興奮性異常及膜離子通道功能紊亂起了更重要的作用。另外,GJ在心臟

2、基因轉(zhuǎn)錄、發(fā)育調(diào)控、缺血心肌的保護(hù)等方面也發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
　　已知Cx43構(gòu)成的GJ通道的功能受到胞內(nèi)pH值、胞內(nèi)Ca2+濃度、ATP濃度、Cx的磷酸化狀態(tài)、跨通道電壓和一些神經(jīng)體液因子等多因素的調(diào)節(jié),且大多數(shù)的功能調(diào)節(jié)位點(diǎn)位于胞漿內(nèi)羧基末端。近年的研究發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是很多細(xì)胞功能的重要基礎(chǔ),因此明確心肌細(xì)胞內(nèi)哪些蛋白質(zhì)與Cx43存在相互作用,將非常有利于進(jìn)一步闡明GJ通道蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后加工修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)

3、及定位、量控制及降解等細(xì)胞內(nèi)處理過程,同時(shí)將有助于發(fā)現(xiàn)新的GJ通道蛋白質(zhì)調(diào)控因子,為開發(fā)治療GJ通道異常所致心律失常的蛋白質(zhì)藥物奠定基礎(chǔ)。
　　研究目的:篩選心臟中哪些蛋白質(zhì)與縫隙連接通道連接蛋白43羧基末端之間存在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,為進(jìn)一步研究這些通過相互作用而形成的蛋白質(zhì)復(fù)合體對縫隙連接通道的功能調(diào)控作用打下基礎(chǔ)。
　　研究方法:①通過PCR方法得到編碼心臟Cx43羧基末端(AA235-382)的cDNA片段,并在

4、其兩端分別加上 EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn),應(yīng)用 EcoRI/BamHI酶切PCR產(chǎn)物及pGBKT7空載體,凝膠分離后應(yīng)用T4連接酶進(jìn)行連接;②通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pGBKT7-Cx43-CT轉(zhuǎn)化酵母菌AH109;③通過“尿素/SDS”法從被轉(zhuǎn)化的酵母菌中提取蛋白質(zhì);④應(yīng)用抗C-myc抗體,通過western blot方法檢測“誘餌”蛋白的表達(dá)(即Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT融合蛋白);⑤檢測“誘餌”蛋白自我激活報(bào)告基因與

5、否,并測試是否需以最優(yōu)化3-AT濃度抑制內(nèi)源性His3蛋白表達(dá);⑥將已被“誘餌”質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的AH109與人心臟 cDNA文庫進(jìn)行雜交,嚴(yán)格篩選陽性克隆,并經(jīng)酵母體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用一對一重驗(yàn)證后分離陽性克隆中的cDNA,并測序;⑦將測序所得到的DNA序列輸入美國國立醫(yī)學(xué)圖書館的BLAST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST同源性分析。
　　研究結(jié)果:①誘餌載體測序結(jié)果證明,pGBKT7中的“Gal4 DNA binding domain-C-myc”

6、與Cx43的羧基末端在同一讀框中;②“誘餌”質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AH109酵母菌成功率100％;③從被轉(zhuǎn)化的AH109中能提取到濃度滿意的總蛋白;④Western blot能檢測到特異性條帶,其位置與Gal4-BD-C-myc-Cx43-CT的分子量相當(dāng);⑤“誘餌”蛋白不能自激活報(bào)告基因Ade2和Mel1,但可自激活His3,5 mmol/L的3-AT可有效抑制“誘餌”蛋白本身自激活報(bào)告基因His3,以利于下一步的雜交篩選;⑥cDNA文庫篩選并經(jīng)一