小型豬乳牙和恒牙牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性及其體內(nèi)成骨的研究.pdf

1、干細(xì)胞是機(jī)體各種組織細(xì)胞的最初來(lái)源，具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能，目前，已廣泛用于組織工程學(xué)中培育新的組織和器官。牙髓組織是一種胚胎性的疏松結(jié)締組織，富含成體干細(xì)胞。2000年，Groynthos等從人第三磨牙牙髓分離出具有克隆源性的多潛能細(xì)胞，稱為恒牙牙髓干細(xì)胞DPSCs(dentalpulp stem cells，簡(jiǎn)稱DPSCs)<'[1]>。2003年，NIH施松濤教授發(fā)現(xiàn)兒童脫落乳牙的牙髓內(nèi)也含有具有多向分化潛能的干細(xì)胞

2、，命名為脫落乳牙干細(xì)胞SHEDs(stem cells from human exfoliated decidUOUS teeth，簡(jiǎn)稱SHEDs)<'[2]>。 以往的研究表明，牙髓干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)具有不同的成骨功能<'[3，4]>。將DPSCs與HA/TCP共同植入裸鼠皮下，6周后在HA/TCP的表面，可形成牙本質(zhì)一牙髓復(fù)合體類似結(jié)構(gòu)，牙本質(zhì)特異性蛋白DSPP及骨涎蛋白、骨鈣蛋白表達(dá)陽(yáng)性。將SHEDs與HA/T

3、CP共同植入裸鼠皮下，則形成較多的骨組織及少量的牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)<'[1，2]>。另有研究表明<'[5，6，7]>：體外誘導(dǎo)DPSCs可向骨組織分化，將DPSCs植入到免疫抑制大鼠皮下，可以形成具有血供的類似于人的骨組織結(jié)構(gòu)。目前，SHEDs和DPSCs在體內(nèi)成骨的功能尚不清楚。由于SHEDs和DPSCs在體外培養(yǎng)中具有較高的克隆形成能力及增殖速度，因此它們可能成為骨組織工程中的種子細(xì)胞。 本研究旨在利用與人體相近的大型動(dòng)物小型豬研究

4、SHEDs和DPSCs在體內(nèi)成骨功能及其條件。分為以下三個(gè)部分： 1．DPSCs和SHEDs生物學(xué)特性的研究取5～6月齡的小型豬下頜第一和第二乳切牙及12～13月齡小型豬下頜第一和第二恒切牙牙髓組織，用酶消化法和組織塊法體外培養(yǎng)SHEDs和DPSCs。DPSCs在體外可傳代至20代，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間180天，細(xì)胞狀態(tài)良好。SHEDs在第6代后增殖速度明顯下降，體外生長(zhǎng)約至7～8代，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間80天。兩者有明顯區(qū)別。第三代SHEDs

5、和DPSCs細(xì)胞倍增時(shí)間分別為4.2天和4.8天，SHEDs生長(zhǎng)速度略快。25 cm<'2>的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種2000個(gè)細(xì)胞，SHEDs克隆集落形成率為13/2000個(gè)細(xì)胞，DPSCs克隆集落形成率為7/2000個(gè)細(xì)胞。免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞生物學(xué)特性，SHEDs和DPSCs均表達(dá)間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的典型蛋白Vimentin，且1/5左右的細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)祖細(xì)胞較特異性的標(biāo)志物Stro-1。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞不同的是SHEDs和DPSCs均表達(dá)神

6、經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志nestin和神經(jīng)元發(fā)育早期的標(biāo)志β-tubulin Ⅲ。 2．SHEDs和DPSCs的體外誘導(dǎo)分化分別取第3代小型豬DPSCs和SHEDs，體外向骨組織、脂肪組織及神經(jīng)組織誘導(dǎo)分化。DPSCs和SHEDs在含有15﹪胎牛血清、地塞米松、β甘油磷酸鈉和維生素C的培養(yǎng)液誘導(dǎo)3周，Yon-kossa染色呈現(xiàn)高密度黑色陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域，ALP表達(dá)明顯。經(jīng)IBMX、胰島素、消炎痛和氫化可的松誘導(dǎo)3周后，DPSCs和SHED

7、s均可分化為脂肪細(xì)胞，經(jīng)油紅染色可見橙紅色陽(yáng)性顆粒。挑選單克隆Stro-1陽(yáng)性的SHEDs和DPSCs擴(kuò)增后向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)后免疫熒光鑒定β-tubulin Ⅲ表達(dá)陽(yáng)性， Stro-1表達(dá)陰性。體外培養(yǎng)的DPSCs和SHEDs均具有多向分化潛能，誘導(dǎo)分化情況無(wú)明顯差別。 3．SHEDs和DPSCs與生物材料復(fù)合對(duì)小型豬下頜骨缺損修復(fù)的研究將標(biāo)記有綠色熒光蛋白的SHEDs和DPSCs體外與磷酸三鈣復(fù)合，掃描電鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)

8、狀況，然后回植到小型豬下頜骨骨缺損模型(大缺損2.5×1.5×1.5cm<'3>和小缺損0.5×1.0×1.0cm<'3>)上，觀察其骨修復(fù)功能及其在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸。在16只小型豬下頜骨上制備左右對(duì)稱的16個(gè)小缺損和單側(cè)的8個(gè)大缺損，隨機(jī)分為4組手術(shù)回植：實(shí)驗(yàn)組1：SHEDs+β-FCP組；實(shí)驗(yàn)組2：DPSCs+β-TCP組；對(duì)照組：?jiǎn)渭儲(chǔ)?TCP組；空白對(duì)照組：骨缺損處無(wú)細(xì)胞，無(wú)材料。術(shù)后2周、4周、3個(gè)月、6個(gè)月，將小型豬分批按實(shí)驗(yàn)計(jì)劃處

9、死，進(jìn)行熒光檢查、影像學(xué)檢查、宏觀測(cè)量及組織學(xué)檢查。熒光顯微鏡示，大量的乳牙牙髓干細(xì)胞已分化為骨細(xì)胞，被包埋在骨基質(zhì)中，具有骨小梁結(jié)構(gòu)，部分乳牙牙髓干細(xì)胞長(zhǎng)入材料間隙。術(shù)后6個(gè)月大體觀察及CT顯示，SHEDs+β-TCP組下頜骨明顯肥大，成骨功能最強(qiáng)。DPSCs+β-TCP組下頜骨也有較強(qiáng)的修復(fù)，組織學(xué)檢查未見牙髓一牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)形成。單純?chǔ)?FCP有部分纖維組織修復(fù)骨組織，在空白對(duì)照組，可見下頜骨仍留有較大缺損。 總之：體外培養(yǎng)