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文檔簡介
1、本文從以下幾部分進行了詳細闡述。
第一部分缺氧對人乳腺癌細胞微球體培養(yǎng)的影響.
目的:研究缺氧對人乳腺癌細胞微球體(mammospheres,MSs)培養(yǎng)速率及效率的影響,以探討優(yōu)化乳腺癌干細胞富集方法的可能途徑。
方法;分別在缺氧及常氧狀態(tài)下對經(jīng)化療后的人乳腺癌組織細胞進行無血清懸浮培養(yǎng),并觀察記錄其成球速率。利用流式細胞檢測技術(shù)分別檢測缺氧組與常氧組MSs及MDA-MB-231細胞中CD44+CD24-
2、/Low表型細胞比例。Western blotting檢測三組細胞中乳腺癌干細胞分子標記物CD44、CD24及ALDH1的表達情況。
結(jié)果:缺氧組MSs無論成球速率還是球體直徑均優(yōu)于常氧組MSs,P<0.05。流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)缺氧組MSs中CD44+CD24-/Low表型細胞比例為82.35±6.28%,高于常氧組MSs的1.17±0.05%,P<0.05。Westernblotting檢測提示缺氧組MSs中CD44與ALDH
3、1的表達量顯著高于常氧組MSs與MDA-MB-231細胞。缺氧組MSs中CD24表達量與常氧組MSs及MDA-MB-231細胞無統(tǒng)計學差異,P>0.05。
結(jié)論:缺氧狀態(tài)可以提高MSs無血清懸浮培養(yǎng)速率,且增加MSs中表達乳腺癌干細胞特定分子標記物細胞的比例。缺氧與無血清懸浮非粘附培養(yǎng)MSs相結(jié)合的方法可用于乳腺癌干細胞的分選。
第二部分缺氧對人乳腺癌細胞微球體遷移、侵襲與動物成瘤特性的影響及相關(guān)機制初探。
4、 目的:研究缺氧對人乳腺癌細胞微球體(mammospheres,MSs)遷徙、侵襲及動物成瘤能力的影響,并對其發(fā)生機制做初步探討。
方法:利用細胞劃痕、Transwell實驗檢測缺氧組人乳腺癌細胞微球體細胞(mammospheres-derived cells,MSDCs)與常氧組MSDCs遷徙、侵襲能力之間的差異。通過裸鼠成瘤實驗檢驗缺氧組與常氧組MSDCs在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況,并記錄移植瘤成瘤時間與瘤體體積。免疫組織化學檢
5、測缺氧組及常氧組移植瘤組織中HIF-2α、ABCG2的表達。Western blotting及RT-PCR定量檢測缺氧組MSDCs、常氧組MSDCs與MDA-MB-231細胞中HIF-2α、ABCG2與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)標記物E-Cadherin、Twist、Vimentin、N-Cadherin的表達情況。Western blotting及Real time
6、RT-PCR檢測缺氧組、常氧組裸鼠移植瘤及瘤旁組織中VEGF與EGF的表達。
結(jié)果:細胞劃痕實驗48h后缺氧組MSDCs的修復(fù)指數(shù)92.52±9.36%高于常氧組MSDCs修復(fù)指數(shù)31.75±6.21%,P<0.05。Transwell實驗結(jié)果提示缺氧組MSDCs穿膜細胞數(shù)達到76.24±10.35,而常氧組MSDCs穿膜細胞為27.38±8.18個,P<0.05。缺氧組MSDCs在裸鼠體內(nèi)成瘤速度及移植瘤體積均強于常氧組MS
7、DCs,P<0.05。免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)缺氧組移植瘤組織中HIF-2α與ABCG2表達強于常氧組移植瘤。Western blotting及Real time RT-PCR檢測結(jié)果提示:缺氧組MSDCs中HIF-2α、ABCG2、Twist、Vimentin、N-Cadherin表達量高于常氧組MSDCs及MDA-MB-231細胞,P<0.05。缺氧組MSDCs及常氧組MSDCs中E-Cadherin均低表達,且兩組間無統(tǒng)計學差異,P>
8、0.05。缺氧組移植瘤中VEGF、EGF表達高于常氧組移植瘤與瘤旁組織,P<0.05。
結(jié)論:缺氧狀態(tài)提高MSs的遷徙、侵襲及動物成瘤能力,并且推測其可能機制為缺氧促進MSs中HIF-2α活化,然后誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并上調(diào)VEGF、EGF的表達,從而改變MSs相關(guān)生物學特性。
第三部分ABCG2慢病毒過表達載體構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細胞。
目的:構(gòu)建ABCG2過表達慢病毒載體,并建立人乳腺癌
9、MDA-MB-231細胞ABCG2過表達模型。
方法:應(yīng)用ABCG2過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞,計算其轉(zhuǎn)染效率。并通過Western blotting技術(shù)檢測經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細胞在經(jīng)過傳代培養(yǎng)后,其中ABCG2蛋白的表達情況。
結(jié)果:成功構(gòu)建ABCG2過表達慢病毒載體,在MDA-MB-231細胞中其轉(zhuǎn)染效率為95.6±3.5%。傳代培養(yǎng)后的慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細胞中A
10、BCG2蛋白表達量高于對照組MDA-MB-231細胞,P<0.05。
結(jié)論:ABCG2過表達慢病毒載體能有效轉(zhuǎn)染人乳腺癌MDA-MB-231細胞,并穩(wěn)定表達。
第四部分缺氧對人乳腺癌細胞微球體化療耐藥性的影響及其機制研究。
目的:探討缺氧對人乳腺癌細胞微球體(MSs)化療耐藥性的影響及其相關(guān)機制初步研究,為乳腺癌干細胞化療耐藥性相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ)。
方法:分別在常氧及缺氧條件下對人乳腺癌MDA-
11、MB-231細胞進行無血清懸浮培養(yǎng),并觀察MSs的生長速率及體積變化。MTT比色法檢測缺氧組與常氧組人乳腺癌微球體細胞(mammospheres-derivedcells,MSDCs)及ABCG2過表達慢病毒轉(zhuǎn)染組與對照組MDA-MB-231細胞在不同濃度、不同藥物作用下的存活率(survive Rate,SR)變化。免疫熒光化學法檢測HIF-2α、ABCG2在各組MSDCs中的表達。Westernblotting檢測ABCG2蛋白在缺
12、氧組MSDCs與病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細胞中的表達。Westem blotting及Real-time RT-PCR檢測HIF-2α、ABCG2、P-gp及MDR1在各組MSDCs中的表達情況。
結(jié)果:缺氧組MSs生長速率及球體體積優(yōu)于常氧組。缺氧組MSDCs與慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細胞在化療藥物作用后的生存率下降趨勢相近,在藥物濃度較低時無統(tǒng)計學差異,P>0.05。缺氧組MSDCs在化療藥物作用后的生存率下
13、降趨勢低于常氧組MSDCs與對照組MDA-MB-231細胞,P<0.05。免疫熒光化學檢測發(fā)現(xiàn)HIF-2α及ABCG2在缺氧組MSDCs中的表達強于常氧組。缺氧組MSDCs中HIF-2α、ABCG2及P-gP蛋白表達量均高于在常氧組MSDCs及MDA-MB-231細胞中的表達,P<0.05。Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)ABCG2蛋白在缺氧組MSDCs與慢病毒轉(zhuǎn)染組MDA-MB-231細胞組中表達無統(tǒng)計學差異,P>0.05。R
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