硒對金黃色葡萄球菌誘導奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷和細胞凋亡的影響研究.pdf

1、奶牛乳腺炎是產(chǎn)后重要的常見疾病之一，其主要以病原菌入侵乳腺組織，并通過宿主逃逸機制在乳腺組織生存下來，從而進一步出現(xiàn)免疫細胞在乳腺內(nèi)聚積、活性氧自由基(ROS)蓄積和炎性因子釋放等病理學特征。該疾病每年對奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟損失。硒(Se)是動物機體所必須的微量元素，其主要以硒蛋白的形式存在于機體內(nèi)，發(fā)揮著抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和參與新陳代謝的生理功能。本實驗室的前期研究發(fā)現(xiàn)硒可以提高哺乳期大鼠的免疫能力，提高抗氧化酶活性，抑制

2、炎癥反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)對機體造成的損傷。因此，本實驗通過體外研究硒的抗氧化作用以及硒對凋亡相關(guān)通路蛋白的影響，為防治乳腺炎提供理論依據(jù)。
　　實驗用金黃色葡萄球菌按照MOI=1∶1的比例接種奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)，作用0、1、2、4、6、8、10、12和24h，用CCK8法檢測金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞活力的影響，用LDH檢測試劑盒觀察金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞造成的損傷作用，用流式細胞術(shù)觀察金黃色葡萄球菌對奶

3、牛乳腺上皮細胞ROS水平的影響。結(jié)果顯示:接種金黃色葡萄球菌后，隨著時間的推移，奶牛乳腺上皮細胞活力顯著下降，感染6、8和10h后，活力僅為80％、78.3％和77.3％;但LDH的活性逐漸提高，并在6h后極顯著增加(p＜0.01或p＜0.001);流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，從4h開始，奶牛乳腺上皮細胞內(nèi)ROS水平顯著提高(p＜0.05），當侵襲8h時，ROS水平達到峰值，8h以后ROS水平顯著下降(p＜0.05)。所以，采用MOI=1∶

4、1的比例接種金黃色葡萄球菌侵襲奶牛乳腺上皮細胞6、8、10h造成了細胞的氧化損傷，確定了氧化損傷模型的處理時間。
　　為研究硒在細胞抗氧化反應(yīng)過程中對相關(guān)氧化因子的影響，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的硒（2、4和8μM），檢測硒對金黃色葡萄球菌誘導的奶牛乳腺上皮細胞SOD、CAT、GSH-Px、COX-2和iNOS mRNA的表達影響，T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性的影響和MDA含量影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，金黃色葡萄

5、球菌感染乳腺上皮細胞后，SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表達均無顯著變化。與金黃色葡萄球菌感染組，感染6h后，4、8μM的硒能顯著或極顯著的上調(diào)SOD的mRNA表達(p＜0.05或p＜0.001)，2、4μM的硒能顯著或極顯著的上調(diào)CAT和GSH-Px的mRNA表達(p＜0.05或p＜0.001);感染8h后，8μM的硒能極顯著的上調(diào)SOD和CAT的mRNA表達，2、8μM的硒能極顯著的上調(diào)GSH-Px的mRNA表達(p＜0.01

6、或p＜0.001)。在感染后6、8和10h，與對照組相比，金黃色葡萄球菌極顯著提高COX-2和iNOS的mRNA表達(p＜0.001)。金黃色葡萄球菌感染感染6h后，硒能極顯著抑制這一反應(yīng)(p＜0.001);感染8h后，4μM的硒能極顯著抑制COX-2的mRNA表達(p＜0.001)，硒能極顯著抑制iNOS的mRNA表達(p＜0.001）;感染10h后，2、8μM的硒能極顯著下調(diào)COX-2的mRNA表達(p＜0.001)，4、8μM的硒

7、能極顯著抑制iNOS mRNA表達(p＜0.001)。在感染后6、8和10h，與對照組相比，金黃色葡萄球菌顯著或極顯著抑制了T-AOC、T-SOD、CAT的活性(p＜0.05或p＜0.01)，極顯著增加MDA的含量(p＜0.001)。而與金黃色葡萄球菌感染組，硒能極顯著提高T-AOC、T-SOD、CAT和GSH-Px的活性(p＜0.01或p＜0.001)，極顯著減少MDA的含量(p＜0.001)。
　　金黃色葡萄球菌除了能造成氧化

8、損傷，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，還可導致凋亡相關(guān)因子誘導細胞死亡，從而造成組織結(jié)構(gòu)不完整形成損傷。TLR2受體在金黃色葡萄球菌感染后除可調(diào)節(jié)炎癥信號通路外，還可對凋亡相關(guān)蛋白進行調(diào)節(jié)。為從蛋白水平揭示硒對凋亡信號通路的影響，采用Western Blot技術(shù)對PI3K/AKT/Bcl-2信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達進行檢測。奶牛乳腺上皮細胞分5組，以不添加硒和金黃色葡萄球菌的細胞作為對照組，以金黃色葡萄球菌刺激0.5h的細胞作為金黃色葡萄球菌感染組，以不

9、同濃度的硒(2、4和8μM)預(yù)孵育12h并用金黃色葡萄球菌刺激0.5h的細胞作為實驗組，分別檢測TLR2、AKT、P-AKT、Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3的蛋白表達。實驗結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌刺激乳腺上皮細胞0.5h后，與對照組相比，顯著或極顯著提高TLR2的蛋白水平和AKT的磷酸化水平(p＜0.05或p＜0.001)，極顯著提高了Bax/Bcl-2的比值(p＜0.001)，極顯著增加了Caspase-3的裂

10、解(p＜0.001)，啟動了凋亡程序;與金黃色葡萄球菌感染組相比，8μM的硒能顯著降低TLR2的蛋白水平(p＜0.05），同時8μM的硒能極顯著提高AKT的磷酸化水平(p＜0.01)，2、4和8μM的硒能極顯著降低Bax/Bcl-2的比值(p＜0.001)，進而極顯著的抑制Caspase-3裂解啟動細胞死亡程序(p＜0.001)，很好地保護了細胞。
　　綜上所述，硒可以通過提高機體內(nèi)抗氧化酶的水平和抑制細胞凋亡程序來發(fā)揮抗氧化、保