常見病原菌氨基糖苷類耐藥基因的多態(tài)性和功能研究.pdf

1、[目的]：
　　金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌分別是臨床常見的致病菌和條件致病菌。近年來，由于抗生素的不合理使用，使臨床常見病原菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，給臨床治療造成極大的困難。另外，由于可移動(dòng)DNA元件的存在，使得細(xì)菌的耐藥性傳播更加嚴(yán)重。因此，比較系統(tǒng)、全面地研究耐藥性相關(guān)基因的多樣性、遺傳變異規(guī)律及基因水平轉(zhuǎn)移的分子機(jī)理顯得尤為重要。本課題研究了氨基糖苷類耐藥基因在臨床分離的病原菌的分布及其豐度，尤其研究了金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)

2、桿菌特有的若干種氨基糖苷類耐藥基因的多樣性及其功能，為揭示耐藥性播散的分子機(jī)理打下基礎(chǔ)。
　　[方法]：
　　收集耐藥性基因數(shù)據(jù)庫(ARDB)、其它蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（如Uni-Pro）和核酸序列數(shù)據(jù)庫（如GenBank）等中的與氨基糖苷類抗性酶基因相關(guān)的序列，經(jīng)聚類分析后，提取一致性序列為氨基糖苷類耐藥基因的參考序列。以溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床得到金黃色葡萄球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝

3、腸桿菌、屎腸球菌和糞腸球菌各約200菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，采用堿裂解法提取基因組DNA，并經(jīng)電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí)，再將全部DNA送交深圳華大基因研究院進(jìn)行solexa測序。利用生物信息學(xué)方法對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接、注釋和比較基因組學(xué)分析，分析氨基糖苷類基因的種類及其在不同種屬細(xì)菌中的分布。選擇金黃色葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌特有的氨基糖苷類耐藥基因(aadC、 aadD、aac(6')-Iv)，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行攜帶目的基因單個(gè)菌株的篩選，進(jìn)而克隆目的基

4、因，并對(duì)目的基因進(jìn)行耐藥譜和耐藥性測定。
　　[結(jié)果]：
　　1.我們從數(shù)據(jù)庫中收集到氨基糖苷類耐藥基因型及其亞型序列151條，以它們?yōu)闉閰⒖夹蛄校瑢?duì)測序讀長進(jìn)行mapping，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在金黃色葡萄球菌混合基因組測序序列中，mapping到30條氨基糖苷類耐藥性相關(guān)基因;在鮑曼不動(dòng)桿菌混合基因組測序序列中mapping到29條基因。
　　2.比較8種屬細(xì)菌樣本（鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌、屎腸球菌

5、、金黃色葡球、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌）混合基因組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)aadC和aadD只在金黃色葡萄球菌混合基因組測序序列中存在，而aac(6')-Iv基因只在鮑曼不動(dòng)桿菌混合基因組測序序列中存在。
　　3.將aadC、 aadD和aac(6')-Iv基因設(shè)計(jì)引物，分別對(duì)233株金黃色葡萄球菌和200株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行相應(yīng)基因篩選，結(jié)果篩選到aadC基因陽性金黃色葡萄球菌2株，aadD陽性金黃色葡萄球菌5株，aac(6')-Iv基因陽

6、性鮑曼不動(dòng)桿菌4株。
　　4.對(duì)aadC、 aadD和aac(6')-Iv基因進(jìn)行克隆和MIC測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，aadC、aadD和aac(6'）-Iv基因的部分重組菌(pET32a∷aadC(SA35)/JM109、pET32a∷aadC(SA141)/JM109、pET32a∷ aadD(SA35)/JM109、pET32a∷aadD(SA37)/JM109、pET32a∷aadD(SA39)/JM109、pET32a∷aadD

7、(SA52)/JM109、pET32a∷aadD(SA94)/JM109、pET15b∷aac(6')-Iv(AB181)/JM109、pET15b∷aac(6')-Iv(AB182)/JM109與對(duì)照菌株(pET32a/JM109、pET15b/JM109)比較，對(duì)多種氨基糖苷類抗生素（如妥布霉素、大觀霉素、新霉素、西索米星、小諾米星、核糖霉素）的耐藥性有明顯提高（提高2個(gè)稀釋度以上，最多的大7個(gè)稀釋度）。
　　[結(jié)論]：首先，